楊慶偉 劉延慶 梁海鵬 陳小鵬 彭世龍

1．甘肅省慶陽市人民醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 慶陽 745000；2. 江蘇省揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009

南蛇藤(Celastrus orbiculatus)為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物[1-2]，我國南蛇藤屬植物分布廣泛，以長江以南地區(qū)多見，僅黔南地區(qū)分布就有11種之多。南蛇藤的藤、莖、根、果實均可入藥，有祛風除濕、活血解毒及消腫抗炎之功效，民間常用來治療筋骨疼痛、四肢麻木、風濕性關節(jié)炎、腰腿痛、閉經(jīng)、小兒驚風、痧癥、痢疾、跌打損傷等病癥。

現(xiàn)代醫(yī)藥研究證實，南蛇藤主要含有二氫沉香呋喃倍半萜和生物堿，此外還有萜類、黃酮類、甾體類及鞣質等多種成份。倍半萜類化合物是從南蛇藤中分離得到最多的一類化學成分，結構類型為二氫沉香呋喃型，由于在基本母核上可形成不同的取代基，因而可形成不同類型的二氫沉香呋喃型倍半萜。二氫沉香呋喃型倍半萜作為南蛇藤主要活性成分之一。三萜類化合物目前發(fā)現(xiàn)的4種三萜類化合物分別為南蛇藤素、扁蒴藤素、香樹醇酯和β-香樹醇酯棕櫚酸酯[3]。

近年來，南蛇藤總萜抗腫瘤研究報道較多[4-6]，尤其在消化道腫瘤表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。南蛇藤總萜對肝癌、胃癌、食道癌等消化道腫瘤系統(tǒng)化研究表明，南蛇藤總萜不僅可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，同時在抑制腫瘤血管生成方面也表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性[7]。本研究觀察南蛇藤總萜類化合物(主要為倍半萜類和三萜類化合物)對人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響，檢測南蛇藤總萜類化合物對基因蛋白Bcl-2和血管內皮生長因子(Vascular Endothetial Growth Factor，VEGF)表達的影響，探討南蛇藤總萜類化合物誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡和抑制腫瘤血管侵襲轉移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)由揚州大學醫(yī)學院醫(yī)學分子生物研究所提供，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(另加青霉素100 KU/L、鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.1.2 藥物提取 南蛇藤莖經(jīng)本課題組合作方，中國藥科大學王強教授課題組完成萜類化合物的提取及鑒定[8]。提取流程:同批次的南蛇藤藤莖切斷，粉碎成粉，烘干，95%乙醇加熱回流提取3次，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑得到浸膏，拌入硅藻土，真空低溫抽干，再用乙酸乙酯熱水浴加熱回流，過濾，回收得到乙酸乙酯浸膏(總萜類化合物含量68.3%)，提取物得率約2%。

1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基購于Gbico公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自于Sigma公司；小牛血清購自杭州四季青公司；碘化丙啶(PI)購自晶美公司；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購自Abd serotec公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗鼠IGg購自碧云天生物公司；人血管內皮細胞生長因子(VEGF)ELISA試劑盒購自博士德生物公司；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)購自日本；CO 2恒溫孵箱(REVCO)購自美國；酶標儀(Labsystems Dragon)購自芬蘭；流式細胞儀(FACSAria)購自于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人臍靜脈內皮細胞置于含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、含體積分數(shù)為5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測藥物劑量依賴性 人臍靜脈內皮細胞以8×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，然后加入不同濃度的南蛇藤總萜類化合物稀釋液，使其最終濃度分別為20、40、80、160 μg/mL，對照組用等體積的培養(yǎng)基替代，每個劑量組設6個重復孔。在37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL 的5 mg/mL MTT工作液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器振蕩10 min后。選擇490 nm波長，在自動酶標儀上測定每孔吸光度(A值)，試驗重復3次，計算細胞生長抑制率(IR)=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3 MTT法檢測藥物時間依賴性 選取濃度為40 μg/mL的南蛇藤總萜作用于人臍靜脈內皮細胞24、48、72、96 h，MTT法測定各孔A490 nm值，計算細胞抑制率。對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。具體操作流程和計算方法同上。

1.2.4 流式細胞儀PI單染法檢測細胞凋亡 人臍靜脈內皮細胞以3×105個/孔接種于六孔培養(yǎng)板中，孵育24 h后加入南蛇藤總萜類化合物稀釋液，使其最終濃度分別為20、40、80、160 μg/mL，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。分別孵育24后，收集細胞，離心去上清， PBS洗滌，轉移到EP管中，加入10 μL PI,混勻后于室溫下避光10 min，于流式細胞儀上樣檢測凋亡細胞。

1.2.5 流式細胞儀法檢測Bcl-2蛋白表達的變化 人臍靜脈內皮細胞以4×105個/mL接種于50 mL的細胞瓶中，24 h后加入按倍數(shù)比例稀釋后的南蛇藤總萜各濃度(5～20μL /mL)，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。孵育24h后，收集細胞，調節(jié)其濃度為1×106個/mL，取100 μL的細胞懸液放入1.5mLEP管中，然后加入含有1%多聚甲醛的PBS固定10 min，去上清，加入含有0.1%Triton X-100的PBS，室溫放置15min，PBS予以洗滌，加入稀釋的鼠抗人Bcl-2單抗，予以室溫下留置30 min，PBS再次洗滌，吸取棄上清，加入稀釋的羊抗鼠FITC-IgG，于室溫下避光留置30min，PBS洗滌，最后加入1mL PBS，于流式細胞儀檢測。FI(Fluresence Index，F(xiàn)I)計算Bcl-2熒光指數(shù)公式如下：FI=檢測管細胞平均熒光強度/對照管細胞平均熒光強度。對照管表達FI=1，如FI>1.0為陰性表達，F(xiàn)I<1.0為陽性表達。

1.2.6 ELISA法檢測血管內皮生長因子(VEGF)表達的變化 取對數(shù)生長期人臍靜脈內皮細胞，以每孔3×106個接種于六孔板子中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，加入等體積得南蛇藤總萜類化合物稀釋液(終濃度分別為2.5、5、10、20 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸取細胞培養(yǎng)上清于EP管中，離心去除細胞碎片和雜質后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ锨逡褐蠽EGF蛋白濃度測定按照VEGF檢測試劑盒進行，于酶標儀450 nm處測吸光度(A值)，根據(jù)標準品的A值求出標準曲線方程，并計算出細胞上清中VEGF濃度。

2 結果

2.1 南蛇藤總萜對人臍靜脈細胞增殖的劑量依賴性 隨著南蛇藤總萜藥物濃度分別為20、40、80、160 μg/mL時，南蛇藤總萜對人臍靜脈內皮細胞的抑制率分別為6.11%、13.59%、22.48%、29.61%，存在量效關系，與對照組相比存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。詳見表1。

表1 南蛇藤總萜作用24 h對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

2.2 南蛇藤總萜對人臍靜脈細胞增殖的時間依賴性 選取濃度為南蛇藤總萜40 μg/mL作用于人臍靜脈內皮細胞，分別孵育24 h、48 h、72 h、96 h后，結果顯示藥物作用96 h后，南蛇藤總萜對人臍靜脈內皮細胞最大抑制率可達30.06%，南蛇藤總萜抑瘤效果存在時間依賴性。詳見表2。

表2 不同作用時間南蛇藤總萜(40μg/mL)對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

2.3 南蛇藤總萜類對人臍靜脈細胞凋亡的影響 當南蛇藤總萜濃度分別為20、40、80、160 μg/mL作用人臍靜脈內皮細胞24 h后，通過流式細胞法檢測凋亡率，凋亡率分別為(4.59±1.32)%、(7.64±0.97)%、(12.26±1.68)%、(19.44±2.34)%。160 μg/mL南蛇藤總萜作用人臍靜脈內皮細胞48 h后，細胞凋亡率可達到(23.31±3.42)%。南蛇藤總萜可以誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡，呈劑量依賴性，并且與藥物作用時間呈正相關，與對照組相比存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同濃度的南蛇藤總萜類化合物對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響

2.4 南蛇藤總萜對Bcl-2蛋白表達的影響 當藥物濃度為2.5、5、10、20 μg/mL時，隨著藥物濃度的不斷增大，F(xiàn)I值分別為0.94、0.87、0.77、0.56，F(xiàn)I值在逐步下降，與藥物劑量呈一定的相關性，見表4。可以認為南蛇藤總萜類化合物能夠下調人臍靜脈內皮細胞Bcl-2基因蛋白的表達，與對照組相比，存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.5 南蛇藤總萜對人臍靜脈內皮細胞VEGF分泌含量的影響 ELISA結果表明，不同濃度的南蛇藤總萜作用于人臍靜脈內皮細胞48h后，能夠明顯降低細胞上清中VEGF的含量，隨著藥物濃度成倍數(shù)增加，VEGF的含量逐步下降，存在量效關系(詳見表4)。與對照組相比，存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表4 南蛇藤總萜類化合物對人臍靜脈內皮細胞VEGF和Bcl-2 的影響

3 討論

南蛇藤為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，具有多種成分及生物學活性，南蛇藤總萜類化合物是南蛇藤屬植物重要的抗腫瘤活性成分。近年來研究表明，南蛇藤的有效成分可以通過細胞毒作用、誘導細胞凋亡、逆轉腫瘤多藥耐藥、抑制腫瘤血管生成等多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用。王海波等[9]報道，南蛇藤乙酸乙酯提取物能夠抑制胃癌BGC-803細胞轉移，其機制可能與抑制細胞中絲切蛋白的表達有關。白殊同等[10]研究認為，南蛇藤活性成分Nimbidiol在12.5～50 μmol/L濃度范圍內，能夠有效抑制斑馬魚胚胎節(jié)間血管發(fā)育和大鼠動脈環(huán)周圍血管新生過程，具有明顯的抗血管新生作用，但其作用機制尚未闡明，推測其作用與抑制 VEGF有關。朱耀東等[11]建立腹腔轉移鼠模型，通過不同劑量組南蛇藤提取物的干預，結果證實了南蛇藤提取物能夠明顯抑制腹腔轉移瘤的生長、腹膜種植轉移和肝肺轉移的發(fā)生，呈劑量依賴效應。

本研究選取對數(shù)生長期的人臍靜脈內皮細胞，采用不同劑量的南蛇藤總萜干預。結果表明，南蛇藤總萜可以抑制人臍靜脈內皮細胞增殖，誘導臍靜脈內皮細胞凋亡，存在劑量依賴性和時間依賴性。

細胞的凋亡受眾多相關凋亡基因的調控，包括抗凋亡基因如Bcl-2和凋亡促進基因如Bax、Fas等。研究[12]發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因表達可能是主要的抗凋亡基因，Bcl-2家族蛋白在控制細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，抗凋亡蛋白Bcl-2過度表達常與各種癌癥直接相關。本研究通過流式細胞儀法檢測人臍靜脈內皮細胞Bcl-2蛋白變化，結果證實了南蛇藤總萜能夠下調人臍靜脈內皮細胞Bcl-2蛋白的表達，存在量效關系。腫瘤血管的生成是一種“乏氧”狀態(tài)，過度的異常血管生成在腫瘤進展中起著關鍵作用，這一過程是由組織缺氧引發(fā)的血管內皮生長因子VEGF的過量產(chǎn)生，從而導致的促血管生成因子和抗血管生成因子之間的不平衡所驅動[13]。VEGF是體內一種強效的促血管生成因子，能直接作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞的增殖，增強血管通透性，直接或間接的參與血管生成。在本研究中，不同劑量的南蛇藤總萜干預人臍靜脈內皮細胞，后取細胞上清液通過ELISA法予以檢測，結果證明了南蛇藤總萜能夠下調VEGF的表達，存在量效關系。

綜上所述，本研究證實南蛇藤總萜能夠抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖，誘導其細胞凋亡，降低了腫瘤通過血管侵襲轉移的可能性，其抑制腫瘤血管生成機制可能與下調Bcl-2和VEGF表達有關，以期為后續(xù)研究提供一定的思路。