孫曉萌 李瀟 朱笳悅 韓朔 楊鑫偉 許利平

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一,其高發(fā)病率和高致殘率嚴重影響人們的生活和質(zhì)量,尋找治療的有效藥物,是目前一直研究和觀注的重點。雪旺細胞(Schwann cells,SCs)作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的特有膠質(zhì)細胞,在神經(jīng)損傷與修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[1]。高糖環(huán)境下SCs的正常代謝過程被破壞,從而使神經(jīng)毒性的終產(chǎn)物積累,影響神經(jīng)營養(yǎng)因子,導(dǎo)致細胞凋亡[2]。已有研究表明芍藥苷(paeoniflorin,PF)可以促進高糖培養(yǎng)的SCs的增殖,對抗高糖環(huán)境對SCs增殖的抑制作用[3],并有可能是潛在的神經(jīng)生長促進因子[4]。課題組近期研究發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondriaassociated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)參與了SCs的代謝過程,糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機制與MAMs密切相關(guān),本實驗以MAMs為切入點,圍繞PF調(diào)控MAMs膜上功能蛋白和鈣離子參與SCs凋亡,試圖闡明PF對高糖環(huán)境下SCs凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和藥品

雪旺細胞株RSC96,為中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點實驗室保存細胞株。

芍藥苷,購于中國藥品生物制品檢定所,批號：110736-201035

1.2 主要試劑

葡萄糖(G8150,Sigma)；無水甲醇(20180226,北京化工廠)；PBS(P1020-500,Solarbio)；ER-tracker(P1041,Beyotime)；Mito-tracker(P1048,Beyotime)；高效RIPA組織/細胞裂解液(R0010-100,Solarbio)；anti-Mitofusin2抗體(ab124773,abcam)；DMEM(PM150210,Procell)；胎牛血清(16000-044,Gibco),DMSO(Sigma,D2650-100ml)。

1.3 主要儀器

手持式細胞計數(shù)儀(Millpore,AH01YOUQ)；低溫離心機(Sigma,3K15)；超速離心機(BECKMAN,L-80XP)；高級研究型顯微鏡(Nikon,ECLIPSE 80i)；定制型流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company,BD LSRFortessa)；激光共聚焦顯微鏡(Leica,TCS SP8)；透射電子顯微鏡(Hitachi,HD7700)；基礎(chǔ)電泳儀電源(PowerPacTM),電泳槽(Mini-PROTEAN?Tetra),轉(zhuǎn)印槽(Trans-Blot?),均來自Bio-Rad。

1.4 細胞處理、分組與蛋白樣品提取

1.4.1 RSC96細胞復(fù)蘇與傳代 從-80℃低溫冰箱中取出凍存細胞后迅速放入37℃水浴鍋內(nèi)溫浴1分鐘,將細胞懸液加入預(yù)先加過培養(yǎng)基的離心管內(nèi)1000 r/min離心5分鐘,棄上清,使用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,接種于新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)。鏡下觀察細胞生長狀態(tài),接近長滿時,用0.25%胰酶消化細胞1 mL,顯微鏡下觀察細胞變圓并有部分脫落后,加入含血清培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打貼壁細胞,使其逐漸脫落并制成細胞懸液,接種于新的培養(yǎng)皿中。

1.4.2 實驗分組及給藥 取5個培養(yǎng)瓶分別標記為空白對照組,模型對照組,PF低、中、高劑量組。取RSC96細胞,胰酶消化后制成細胞懸液,采用手持細胞計數(shù)儀進行計數(shù),每個培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5×106個細胞,貼壁培養(yǎng)12小時以上。配置空白對照組(25 mM glucose DMEM+10%FBS),模型對照組(150 mM glucose DMEM+10%FBS),PF低劑量組(150 mM glucose DMEM+10%FBS+1 μM PF),PF中劑量組(150 mM glucose DMEM+10%FBS+10 μM PF),PF高劑量組(150 mM glucose DMEM+10%FBS+100 μM PF)。取出貼壁的RSC96細胞,吸棄培養(yǎng)基,加入以上配置好的藥品,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時與48小時。

1.4.3 MAMs蛋白提取 采用胰酶將培養(yǎng)24小時與48小時的細胞消化成懸液后,轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中。采用4℃低溫冷凍離心機800 g,離心10分鐘,取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；更改離心條件為9000 g,離心10分鐘,棄上清,用PBS將沉淀吹散；更改離心條件為10000 g,離心10分鐘,重復(fù)2次后取沉淀；采用超速離心機設(shè)置為95000 g,離心30分鐘。吸出大約距管底約1 cm處的漂浮于溶液中的環(huán)狀絮狀白色固體于離心管中,更改離心條件為6300 g,離心10分鐘后取沉淀。再次采用超速離心法,更改條件為100000 g,離心30分鐘,沉淀部分為MAMs蛋白。

1.5 觀察指標

1.5.1 激光共聚焦觀察MAMs形態(tài)與數(shù)量 取LAB-TekTMII腔室蓋玻片8孔板,分別標記為空白對照組,模型對照組,PF低劑量組,PF中劑量組和PF高劑量組。取RSC96細胞鋪板后貼壁生長12小時后,吸棄培養(yǎng)基加藥,同1.4.2。吸棄培養(yǎng)液,每孔加入300 μL Mito-tracker工作液,于37℃孵育50分鐘。PBS清洗3次后,加入ER-tracker工作液于37℃孵育30分鐘。去除工作液,加入新鮮配置的細胞培養(yǎng)液。采用STED超高分辨率共聚焦顯微鏡觀察活細胞。每組4個樣本,每個樣本隨機選取6個區(qū)域,采用積分光密度法計數(shù),將6個區(qū)域的均值作為每個樣本的光密度。對Merge后線粒體標記蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記蛋白重疊的部分,以積分光密度衡量含量,進行數(shù)據(jù)分析。

1.5.2 Western blot法檢測線粒體融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)表達 將含DTT的上樣緩沖液與MAMs蛋白樣品1∶3體積混合,于沸水變性。冷卻后分裝存放于-20℃待測。在10%SDS-PAGE凝膠孔中加入等量蛋白進行電泳分離,并使用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫孵育2小時后采用MFN2抗體(1∶2000)4℃孵育過夜,TBST浸洗后,繼續(xù)室溫孵育山羊抗兔抗體1小時,使用TBST浸洗,加入超敏發(fā)光液后使用發(fā)光顯影儀曝光。應(yīng)用Image J軟件對圖片進行分析獲得灰度值,以β-actin為內(nèi)參,每組重復(fù)4次,計算相對蛋白含量。

1.5.3 Elisa法檢測蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)蛋白表達 采用MAMs蛋白,取PERK ELISA試劑盒,于室溫(20～25℃)放置30分鐘。取出酶標板,按照標準品的次序依次分別加入100 μL的標準品溶液于空白微孔中。在空白微孔中加入100 μL樣品,再加入10 μL平衡液。在各孔加入50 μL的酶標記溶液,37℃孵育1小時。充分清洗酶標板后,用吸水紙徹底拍干。各孔依次加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL。于20～25℃下避光反應(yīng)10分鐘后,加入50 μL終止液以終止反應(yīng)。將微孔板置于450 nm波長的酶標儀下進行讀數(shù)(吸光度值即為OD值)。每組重復(fù)4次,以標準品的OD值做標準曲線,將樣品的數(shù)據(jù)帶入標準曲線中獲得蛋白含量。

1.5.4 流式細胞術(shù)檢測細胞Ca2+水平 將細胞分為空白對照組,模型對照組,PF低、中、高劑量組；分別鋪板加藥后,孵育24小時和48小時(同1.4.2)。采用無EDTA胰酶消化細胞,并收集于2 mL離心管中。加入1 mL培養(yǎng)基,1000 r/min離心5分鐘后,吸棄培養(yǎng)基。加入500 μL的Fluo-AM3(0.5 μm),將細胞吹打均勻,37℃孵育30分鐘后,1000 r/min離心5分鐘。吸棄250 μL上清液,繼續(xù)加入250 μL的PBS,37℃孵育30分鐘。1000 r/min離心5分鐘后,吸棄上清液。加入500 μL的PBS,將細胞吹打均勻后,使用流式細胞分析儀進行細胞內(nèi)Ca2+水平檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標準差(±s)表示。多組樣本比較采用單因素方差分析,方差齊性條件下,選擇LSD分析,方差不齊性條件下,選擇Tambane's T2分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PF對高糖環(huán)境下MAMs的形態(tài)與含量

SCs呈梭形,綠色部分為線粒體,由Mito-tracker標記；紅色部分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng),由ER-tracker標記；重疊部分為MAMs。統(tǒng)計結(jié)果顯示干預(yù)24小時和48小時后：與空白對照組比較,模型對照組MAMs含量顯著降低(P＜0.01),SCs梭形不明顯,形態(tài)變小不規(guī)則；與模型對照組比較,PF各組MAMs含量顯著增加(P＜0.01),SCs形態(tài)得到改善,趨于棱形,見圖1、圖2 與表1。

圖1 共聚焦觀察24小時高糖環(huán)境下的MAMs形態(tài)(×630)

圖2 共聚焦觀察48小時高糖環(huán)境下的MAMs形態(tài)(×630)

表1 高糖環(huán)境下SCs中MAMs的共聚焦積分光密度(n=4,±s)

表1 高糖環(huán)境下SCs中MAMs的共聚焦積分光密度(n=4,±s)

注：與空白對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.01。

1.00±0.12 1.00±0.09模型對照組 0.49±0.17a 0.52±0.12a PF 低劑量組 0.87±0.13b 0.89±0.19b PF 中劑量組 0.65±0.14b 0.78±0.10b PF 高劑量組 0.74±0.20b 0.69±0.11小時空白對照組組別 24小時 48 b

2.2 PF對高糖環(huán)境下MAMs中Mfn2表達

Mfn2低表達影響細胞代謝。RSC96細胞干預(yù)24小時和48小時后：與空白對照組比較,模型對照組Mfn2表達顯著降低(P＜0.01)；與模型對照組比較,PF各劑量組Mfn2表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),見表2。

表2 PF對高糖環(huán)境下MAMs中Mfn2的影響(n=4,±s)

表2 PF對高糖環(huán)境下MAMs中Mfn2的影響(n=4,±s)

注：與空白對照組比較aP＜0.01；與模型對照組比較bP＜0.01。

組別 24小時 48 1.00±0.13 1.00±0.10模型對照組 0.50±0.10a 0.59±0.10a PF 低劑量組 0.85±0.12b 0.82±0.16b PF 中劑量組 0.72±0.20b 0.80±0.11b PF 高劑量組 0.64±0.17b 0.70±0.10小時空白對照組b

2.3 PF對高糖環(huán)境下MAMs中PERK表達

PERK的過度激活會促進細胞凋亡。干預(yù)RSC96細胞24小時和48小時：與空白對照組比較,模型對照組PERK表達明顯升高(P＜0.01)；與模型對照組比較,芍藥苷低劑量組和芍藥苷中劑量組PERK表達顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),芍藥苷高劑量組表達也有明顯下降(P＜0.05),見表3。

表3 PF對高糖環(huán)境下MAMs中PERK的影響(n=4,±s)

表3 PF對高糖環(huán)境下MAMs中PERK的影響(n=4,±s)

注：與空白對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較bP＜0.05,cP＜0.01。

組別 24小時 48 1.00±0.02 1.00±0.02模型對照組 1.44±0.10a 1.55±0.11a PF 低劑量組 1.18±0.09c 1.01±0.08c PF 中劑量組 1.25±0.09c 1.16±0.15c PF 高劑量組 1.30±0.12b 1.39±0.15小時空白對照組b

2.4 芍藥苷對高糖環(huán)境下RSC96細胞Ca2+水平

Ca2+水平的上升是細胞凋亡的誘導(dǎo)因素之一。與空白對照組相比,模型對照組Ca2+水平顯著升高(24小時升高3.63倍,48小時升高2.05倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01)。與模型對照組比較,芍藥苷各劑量組均能夠顯著降低Ca2+水平,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；提示PF能夠緩解高糖誘導(dǎo)的細胞Ca2+水平,見表4。

表4 PF對高糖環(huán)境下RSC96細胞Ca2+的影響(n=4,±s)

表4 PF對高糖環(huán)境下RSC96細胞Ca2+的影響(n=4,±s)

注：與空白對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較bP＜0.01。

1.00±0.10 1.00±0.12模型對照組 3.63±0.12a 2.05±0.10a PF低劑量組 1.21±0.08b 1.06±0.09b PF中劑量組 1.61±0.09b 1.09±0.09b PF高劑量組 1.55±0.12b 1.15±0.08小時空白對照組組別 24小時 48 b

3 討論

高血糖誘導(dǎo)的SCs病變是糖尿病周圍神經(jīng)病變的主要發(fā)病機制之一,SCs在神經(jīng)損傷的修復(fù)中起著重要作用。氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均能夠引起SCs凋亡。高糖環(huán)境下未折疊蛋白的過度堆積引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5],激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK,繼而引發(fā)細胞凋亡[6-7]。

近年研究發(fā)現(xiàn)[8],線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間存在由特定蛋白質(zhì)經(jīng)由物理連接形成的亞細胞器結(jié)構(gòu),即MAMs。MAMs[9-10]經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互調(diào)控,其機制與MAMs上多種功能蛋白和Ca2+信號密切相關(guān)。Mfn2作為線粒體外膜上一種跨膜GTP酶,介導(dǎo)線粒體融合,參與細胞能量代謝、增殖及凋亡等。研究還發(fā)現(xiàn)[11-12]Mfn2不僅參與調(diào)控線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu),還與細胞代謝、增殖、凋亡密切相關(guān)。Mfn2能夠引起下調(diào)Ca2+內(nèi)流,緩解細胞內(nèi)鈣超載從而緩解細胞凋亡。PERK[13]是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種跨膜蛋白,PERK信號通路的激活在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期可以通過抑制蛋白的合成發(fā)揮保護細胞的作用,促進細胞生存。但隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時間的延長,PERK則會促進細胞的凋亡。SCs的凋亡影響周圍神經(jīng)功能,進一步影響糖尿病周圍神經(jīng)病變。已有研究[14]表明,Mfn2是PERK的上游調(diào)節(jié)劑,并在物理上與PERK相互作用,Mfn2損傷的細胞在基礎(chǔ)條件下表現(xiàn)出PERK的持續(xù)激活。早期PERK能夠使線粒體鈣正?；?但后期則誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)流進入線粒體的Ca2+增加,促進鈣超載,引發(fā)細胞凋亡。

赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.或川赤芍P.vertchiiLynch的根,在糖尿病周圍神經(jīng)病變的辨證論治中,結(jié)合糖尿病“陰虛為本,燥熱為標”的特點,常配伍在復(fù)方中[15-16]用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變。課題組前期研究[17]也發(fā)現(xiàn),PF通過Nrf/ARE途徑減輕線粒體氧化應(yīng)激,降低SCs中氧自由基的含量,從而減輕SCs凋亡,保護周圍神經(jīng)而改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。

本實驗的結(jié)果示高糖環(huán)境下SCsCa2+明顯增多,影響MAMs的形態(tài)和含量,引起細胞凋亡。結(jié)果還顯示Mfn2表達下降,影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)異常；PERK表達的增加,也會導(dǎo)致細胞凋亡。Mfn2表達下降同時Ca2+增加,PERK表達也增加的現(xiàn)象證明Mfn2能夠下調(diào)Ca2+,且能夠下調(diào)PERK的表達。當用PF干預(yù)高糖環(huán)境的SCs后,影響MAMs的PERK表達量,48小時較24小時時間點的差異性更大,說明隨著時間的增加,PF抑制PERK的表達更加明顯,同時Ca2+水平下降更顯著,具有一定的時效關(guān)系。PF干預(yù)后,Mfn2表達顯著提升的同時表現(xiàn)為Ca2+水平顯著下降,細胞凋亡緩解,MAMs的含量提升,PERK的表達降低,接近正常水平,表明PF通過上調(diào)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上 Mfn2的表達,而Mfn2能夠下調(diào)PERK的表達,進而緩解鈣超載,從而減輕SCs的凋亡,緩解糖尿病周圍神經(jīng)病變。

綜之,PF能夠改善高糖環(huán)境下SCs的MAMs的結(jié)構(gòu)含量和功能蛋白,改善SCs形態(tài),減輕SCs凋亡,有利于改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。這與其能夠上調(diào)Mfn2的表達,抑制PERK表達,降低細胞內(nèi)Ca2+濃度,減輕鈣超載有關(guān)。