魯 庚 唐 鑫 陸俊杏 李 丹 胡秋蕓 胡 田 張 濤

研究簡(jiǎn)報(bào)

紫蘇二?；视王；D(zhuǎn)移酶2基因克隆與功能研究

魯 庚 唐 鑫 陸俊杏 李 丹 胡秋蕓 胡 田 張 濤*

重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 401331

二?；视王；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)是植物合成三酰甘油(TAG)最后一步的關(guān)鍵酶, 其中DGAT2在某些植物的種子油中能選擇性積累更多不飽和脂肪酸。本文成功克隆了紫蘇二?；视王；D(zhuǎn)移酶2基因(), 并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明, 不同器官中基因均有表達(dá), 10 d種子的表達(dá)量最高, 在根中的表達(dá)量次之,在種子發(fā)育中后期,表達(dá)量逐漸降低。與野生型擬南芥相比, 過(guò)表達(dá)擬南芥種子含油率提高了21.68%~77.89%, 其中種子含油率增加最多的4個(gè)株系, 其亞麻酸(C18:3)增加4.57%, 花生一烯酸(C20:1)增加7.44%, 花生二烯酸(C20:2)增加5.4%, 二十二一烯酸(C22:1)增加10.37%, 而棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和亞油酸(C18:2)含量分別降低了3.47%、6.64%和4.83%, 油酸(C18:1)和花生酸(C20:0)分別只降低了0.18%和1.91%。本研究結(jié)果表明, 紫蘇基因不僅能提高種子含油率, 還能促進(jìn)亞麻酸、花生一烯酸等不飽和脂肪酸的積累, 這為研究植物不飽和脂肪酸的合成積累提供了參考及理論依據(jù)。

二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT2); 種子含油率; 不飽和脂肪酸; 紫蘇

三?；视?TAG)是植物種子中的主要儲(chǔ)存脂質(zhì), 是植物油的主要形式。植物油是重要的可再生能源, 可用于食品和飼料, 并且正日益成為生物柴油和工業(yè)化學(xué)品的原料[1-2]。植物油含較高的不飽和脂肪酸, 可以降低動(dòng)脈硬化發(fā)生的概率。其中, 多不飽和脂肪酸α-亞麻酸是人體組織細(xì)胞的主要組成成分, 人體缺乏α-亞麻酸會(huì)引起健忘、疲勞、視力減退、動(dòng)脈硬化等癥狀[3]。隨著對(duì)多不飽和脂肪酸需求的增加, 需要開(kāi)發(fā)具有高含油量和高不飽和脂肪酸的油料作物。唇形科一年生草本植物紫蘇[(L.) Britt], 因其種子出油率達(dá)45%以及含大量多不飽和脂肪酸α-亞麻酸(60%以上)而成為人們重點(diǎn)關(guān)注的新型油料作物[4-5]。通過(guò)克隆紫蘇基因, 研究其表達(dá)模式及功能, 對(duì)提高植物含油率、促進(jìn)不飽和脂肪酸合成積累具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和理論意義。

TAG的生物合成涉及質(zhì)體中脂肪酸的生物合成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中TAG的組裝2個(gè)主要階段。脂肪酸的生物合成主要是乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)將乙酰輔酶A活化為丙二酰輔酶A, 然后將丙二?；鶑腃oA轉(zhuǎn)移到?；d體蛋白(ACP)作為?；溳d體, 合成的脂肪酸則輸出到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)[6]。在肯尼迪途徑中, 三磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)、溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)和二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)催化三磷酸甘油骨架鏈上?；磻?yīng), 最后生成三酰甘油[7-8]。其中DGAT是用于TAG合成的最后一種酶, 它將第3個(gè)?；溙砑拥紻AG并產(chǎn)生TAG。目前, 在植物中鑒定出DGAT1、DGAT2、DGAT3[8-9]和WS/ DGAT[10]4種類型的DGAT。DGAT1和DGAT2在真核生物中普遍存在, 它們是2個(gè)結(jié)構(gòu)不同的膜結(jié)合?；D(zhuǎn)移酶, 沒(méi)有序列同源性[12]。另外, DGAT1和DGAT2在底物特異性和表達(dá)模式等方面也不同[12-14]。Saha等[8]在花生子葉中克隆出了第3類可溶性DGAT酶, 命名為DGAT3, 定位于細(xì)胞質(zhì)中。第4種類型的DGAT酶是從醋酸鈣不動(dòng)桿菌ADP1鑒定的雙功能膜相關(guān)酶, 同時(shí)具有WS和DGAT活性[15-16]。在擬南芥和矮牽牛中的WS / DGAT同源物主要是催化蠟酯的合成[16-17]。有研究表明, 擬南芥的二?；视王；D(zhuǎn)移酶1 (DGAT1)是油脂中正常TAG積累所必需的[18-20]。但是, 擬南芥中的作用尚不清楚, 因?yàn)橥蛔凅w與敲除突變體雜交后種子的含油量并沒(méi)有明顯降低[12]。與擬南芥相比, 蓖麻胚乳中的在種子中積累了大量的TAG (含90%以上蓖麻酸)[21]。此外, Shockey等[13]表明,可能參與異常脂肪酸、桐油酸和桐油的選擇性積累。隨后Oelkers[22]表明, 蓖麻能與蓖麻羥化酶共同表達(dá), 在擬南芥種子中使羥基脂肪酸積累加倍(從~17%到~30%)。Li等[23]也證明了斑鳩菊、大戟和琉璃菊中的和積累了更高的環(huán)氧和羥基脂肪酸。Yuan等[24]通過(guò)在擬南芥中過(guò)表達(dá)油棕, 提高了擬南芥種子TAG中多不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸的含量, 硬脂酸和花生酸的比例也相應(yīng)降低。在最近的研究中, Zheng等[25]在擬南芥中過(guò)表達(dá)椰子, 導(dǎo)致擬南芥種子的亞油酸含量顯著增加, 二十碳一烯酸和花生酸的比例降低。因此, DGAT2在某些植物種子油中選擇性積累不飽和脂肪酸方面所起的作用比DGAT1更為顯著[12]。

α-亞麻酸能預(yù)防心血管疾病, 也可增強(qiáng)智力、保護(hù)視力、抑制衰老和血小板聚集[26-27]。紫蘇是目前發(fā)現(xiàn)含α-亞麻酸最高的植物, 但迄今為止, 對(duì)紫蘇基因的研究非常少, 僅有梁倩等[28]克隆了該基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)及表達(dá)性分析, 而對(duì)的表達(dá)模式及生物學(xué)功能等迄今未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆了基因并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其序列進(jìn)行了分析, 在此基礎(chǔ)上, 分析不同組織、種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性, 構(gòu)建植物表達(dá)載體, 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥, 研究過(guò)表達(dá)擬南芥種子的含油率及脂肪酸組分的變化, 可為植物高含量不飽和脂肪酸積累的分子機(jī)理提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫蘇、擬南芥種子由重慶師范大學(xué)油用牡丹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。于2018年4月將紫蘇種植于重慶師范大學(xué)植物園, 9月采集花、葉、莖、根以及花后5、10、15、20、25、30 d不同發(fā)育階段的種子, 液氮冷凍運(yùn)輸, 然后在-80℃冰箱保存待用。所有擬南芥種子均經(jīng)2%次氯酸鈉表面消毒, 播種在1/2 MS培養(yǎng)基上, 將22℃長(zhǎng)日條件下的2周齡植物移栽到土壤(營(yíng)養(yǎng)土∶細(xì)土∶珍珠巖 = 1.0∶3.0∶0.5)中。

1.1.2 菌株和試劑 大腸桿菌DH5α、Premix酶、DL2000 Marker、T/A克隆載體pMD19-T、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于TaKaRa公司, 植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)于天根生化有限公司, 熒光定量試劑盒購(gòu)于成都百樂(lè)公司, 根瘤農(nóng)桿菌GV3101、表達(dá)載體pCAMBIA1303由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇總RNA提取及cDNA合成 利用植物RNA快速提取試劑盒提取紫蘇根、莖、葉、花、不同時(shí)期種子(5、10、15、20、25、30 d)的總RNA, 保存于-80℃?zhèn)溆谩２捎肦T Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-Time)試劑盒方法, 以提取的RNA為模板, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2基因的克隆 從實(shí)驗(yàn)室前期紫蘇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中挑選出功能注釋為的基因[29], 以擬南芥為參照, 利用BioEdit軟件比對(duì)分析, 獲得紫蘇全長(zhǎng)。采用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)5'端及3'端全長(zhǎng)特異性引物。反應(yīng)引物為PfDGAT2 F和PfDGAT2 R (表1)。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與載體pMD-T 19連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài), 篩選藍(lán)白斑陽(yáng)性克隆, PCR鑒定挑選單克隆送測(cè)序, 引物及測(cè)序均由英濰捷基有限公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將得到的用Vector NTI Advance 11進(jìn)行序列比對(duì)和蛋白質(zhì)翻譯, 利用在線分析軟件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)PfDGAT2氨基酸序列的等電點(diǎn)、分子量以及氨基酸數(shù)目等基本理化參數(shù); 利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)、TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽及分析該蛋白跨膜域, 使用CCD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析, 利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)分析, 采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建同源蛋白進(jìn)化樹。

1.2.4基因組織特異性表達(dá)分析 根據(jù)已克隆的cDNA序列分析結(jié)果, 設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物(表1), 以紫蘇和作為內(nèi)參基因, 參照試劑盒SYBR Premix ExII在CFX96 Real-Time PCR Detection System儀器(Bio-Rad公司)上進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè), 反應(yīng)體系為10 μL, 包含SYBR Green supermix 5.0 μL、上下游引物各0.5 μL、Template 4.0 μL; 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60 s; 95℃變性10 s, 60℃退火20 s, 40個(gè)循環(huán); 反應(yīng)結(jié)束后再升溫至95℃, 最后進(jìn)行溶解曲線分析。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 用限制性內(nèi)切酶II酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1303, 設(shè)計(jì)帶有II酶切位點(diǎn)的1對(duì)引物DGAT2-BglII F和DGAT2-BglII R (表1), 采用In-Fusion無(wú)縫克隆得到過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒 WT: Pro35S, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中, 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。農(nóng)桿菌侵染的當(dāng)代植株為T0代, 單株收的每代種子經(jīng)1/2 MS培養(yǎng)基(含30 mg mL–1潮霉素)篩選后移栽至溫室生長(zhǎng), 鑒定陽(yáng)性苗使用分子鑒定, 分子鑒定引物為JD-F、JD-R (表1)。

表1 PCR引物

1.2.6 擬南芥種子含油率、脂肪酸組分的測(cè)定 使用Li等[30]的方法, 并做了部分改動(dòng), 提取擬南芥種子總油。分別采收PD2-1至PD2-9轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的T2代成熟種子, 干燥后使用1/1000天平稱取每個(gè)株系的種子0.05 g, 重復(fù)5~10次。研缽研磨后加入氯仿∶甲醇(2∶1)混勻, 離心取下層氯仿相至玻璃管, 用氮吹儀濃縮干至恒重后稱量, 計(jì)算含油率。利用GC-MS (島津Trace1310-ISQ單四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀)測(cè)定脂肪酸組分, 參照付松等[31]的脂肪酸甲酯化方法, 有所改動(dòng)。取油脂于10 mL玻璃試管中, 加異辛烷(含0.001% BHT)溶解, 再加氫氧化鉀-甲醇溶液, 旋渦震蕩2 min后靜置10 min, 最后加8% NaCl離心取上清液過(guò)油系濾膜待用。GC–MS進(jìn)樣體積1 μL; 程序升溫: 起始溫度180℃, 保持1 min, 以15℃ min-1升至230℃, 保持6 min; 高純氮?dú)廨d氣, 流速1.0 mL min-1; 進(jìn)樣口溫度250℃; 脈沖分流進(jìn)樣, 分流比35∶1, 脈沖壓力120 kPa。傳輸線溫度為230℃, 離子源溫度230℃, 質(zhì)量掃描范圍(m/z) 40~400 amu。對(duì)每個(gè)株系總脂提取及脂肪酸甲酯化, 設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)分析基因表達(dá)量、擬南芥種子含油率及脂肪酸組分等數(shù)據(jù)并作圖。使用2–ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量, 利用DPS 7.05軟件進(jìn)行基因表達(dá)差異顯著性分析、種子含油率和脂肪酸組分的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PfDGAT2克隆及生物信息學(xué)分析

以紫蘇不同時(shí)期種子混樣的cDNA為模板,用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 獲得全長(zhǎng)為1200 bp的(圖1-A), 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果與預(yù)測(cè)大小一致。生物信息學(xué)分析表明,基因開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)長(zhǎng)為990 bp, 編碼329個(gè)氨基酸, 使用在線分析軟件ProtParam分析表明,基因蛋白質(zhì)分子量為37.01 kD, 等電點(diǎn)為9.55, 不穩(wěn)定系數(shù)為43.06, 為不穩(wěn)定蛋白。SignaIP server預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽, TMHMM Server v.2.0分析該蛋白有2個(gè)跨膜域。蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析表明, PfDGAT2屬于LPLAT蛋白超家族(圖1-B)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究紫蘇與擬南芥、煙草、玉米等植物間的親緣關(guān)系, 利用MEGA4.0軟件對(duì)紫蘇、芝麻(XP_011098009.1)、蓖麻(NP_001310616.1)、擬南芥(OAP06431.1)、大豆(NP_001299586.1)、蒺藜苜蓿(XP_003612436.1)、麻瘋樹(NP_001292973.1)、可可(EOX90582.1)、亞麻薺(XP_010426724)、煙草(AGL46984.1)、甘藍(lán)型油菜(XP_013734399.2)、馬鈴薯(XP_006365015.1)和玉米(AQL03437.1)的DGAT2候選蛋白進(jìn)行系統(tǒng)樹分析表明(圖2), 紫蘇與油菜、蓖麻、可可等雙子葉植物的DGAT2聚為一支, 與單子葉植物玉米親緣關(guān)系最遠(yuǎn), 其進(jìn)化基本符合植物進(jìn)化分類。其中, 紫蘇與芝麻SiDGAT2親緣關(guān)系最近, 其次與煙草、馬鈴薯蛋白親緣關(guān)系較近; 與蓖麻、可可樹等其他物種的DGAT2蛋白在進(jìn)化上的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 推測(cè)紫蘇基因的功能可能與芝麻基因相似。多序列比對(duì)分析(圖3)發(fā)現(xiàn),編碼的蛋白與其他植物DGAT2蛋白相似, 具有YFP、EPHS、GGVQE、VPVFCFG和VVGRPI五個(gè)典型的植物DGAT2酶的保守結(jié)構(gòu)域。

圖1 PfDGAT2基因的克隆與分析

A:的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, M: DL2000 DNA marker。B: PfDGAT2 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果。

A: PCR amplification product of, M: DL2000 DNA marker. B: conserved domains analysis of PfDGAT2 protein.

2.3 PfDGAT2基因組織特異性表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量分析表明,在紫蘇不同組織中均有表達(dá), 在發(fā)育初期10 d種子中表達(dá)量最高, 根中表達(dá)量次之, 但與其他組織相比, 5 d種子表達(dá)量最低, 且在10 d種子后, 隨著種子發(fā)育成熟,表達(dá)量呈降低趨勢(shì)(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油率、脂肪酸組分分析

經(jīng)潮霉素篩選并分子鑒定后, 最終得到9個(gè)轉(zhuǎn)基因株系, 命名為PD2-1至PD2-9。單株收取9個(gè)株系T2代種子測(cè)含油率, 選含油率最高的4個(gè)株系分析脂肪酸組分。由圖5可知, 與野生型擬南芥相比, 轉(zhuǎn)基因種子含油率提高了21.68%~77.89%, 其中PD2-1、PD2-3、PD2-5、PD2-8株系種子含油率增加最多, 分別增加了53.04%、62.10%、77.89%和47.01%。PD2-1、PD2-3、PD2-5、PD2-8四個(gè)株系的脂肪酸組分(圖6), 與對(duì)照相比, 亞麻酸(C18:3)增加了4.57%, 花生一烯酸(C20:1)增加了7.44%, 花生二烯酸(C20:2)提高了5.4%, 而二十二一烯酸(C22:1)含量提高了10.37%。棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和亞油酸(C18:2)顯著降低, 分別降低了3.47%、6.64%和4.83%。油酸(C18:1)和花生酸(C20:0)呈降低趨勢(shì), 但變化不明顯, 分別只降低了0.18%和1.91%。這說(shuō)明,所編碼的DGAT2酶不僅顯著提高種子含油率, 還提高亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量, 顯然,在TAG組裝過(guò)程中傾向于以不飽和脂肪酸亞麻酸、花生一烯酸、花生二烯酸和二十二一烯酸作為底物。

圖2 不同植物DGAT2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)的可信度。

The number on the branches represents the reliability percent of bootstraps values based on 1000 replications.

圖3 不同植物DGAT2蛋白序列比對(duì)分析

PfDGAT2: 紫蘇; SiDGAT2: 芝麻(XP_011098009.1); StDGAT2: 馬鈴薯(XP_006365015.1); AtDGAT2: 擬南芥(OAP06431.1); GmDGAT2: 大豆(NP_001299586.1); NtDGAT2: 煙草(AGL46984.1); CsDGAT2: 亞麻薺(XP_010426724)。黑色方框內(nèi)依次為DGAT2蛋白的YFP、EPHS、GGVQE、RXGFX(K/R)XAXXXGXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)和VVGRPI的保守結(jié)構(gòu)域。

PfDGAT2:; SiDGAT2:(XP_011098009.1); StDGAT2:(XP_006365015.1); AtDGAT2:(OAP06431.1); GmDGAT2:(NP_001299586.1); NtDGAT2:(AGL46984.1); CsDGAT2:(XP_010426724). In the black box there are the YFP, EPHS, GGVQE, RXGFX(K/R)XAXXXGXX(L/V) VPXXXFG(E/Q), and VVGRPI conserved domains in turn.

圖4 PfDGAT2基因不同組織和種子不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

柱值標(biāo)以不同字母表示在< 0.05水平差異顯著性。數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(= 3)。

Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05. Data points are means±SE (= 3).

圖5 轉(zhuǎn)PfDGAT2擬南芥種子含油率

柱值標(biāo)以不同字母表示在< 0.05水平差異顯著性。數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(= 3)。

Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05. Data are means±SE (= 3).

圖6 轉(zhuǎn)PfDGAT2擬南芥種子脂肪酸相對(duì)含量分析

圖中*為PD2-1、PD2-3、PD2-5、PD2-5與野生型Col-0之間各組分顯著性分析。*代表在< 0.05時(shí)顯著性的差異, **代表在< 0.01時(shí)顯著性的差異, ***代表在< 0.001時(shí)顯著性的差異。數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(= 3)。

In the figure, * shows significant difference of each component of PD2-1, PD2-3, PD2-5 with wild-type Col-0. * represents the significant difference at< 0.05, ** represents significant difference at< 0.01, *** represents significant difference at< 0.001. Data are means±SE (= 3).

3 討論

TAG是植物油最重要的儲(chǔ)存形式, 隨著對(duì)TAG合成研究的不斷深入, 作為催化TAG合成積累途徑中的最后一步,的表達(dá)模式及功能受到了極大的關(guān)注。本研究在紫蘇中克隆得到編碼329個(gè)氨基酸的基因, PfDGAT2包含2個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域, 此外, 它還具有DGAT2的保守結(jié)構(gòu)域(圖3), 其中YFP和EPSH是DGAT2蛋白的關(guān)鍵酶活性位點(diǎn)。Stone等[32]在釀酒酵母中突變基因發(fā)現(xiàn), YFP是的關(guān)鍵保守結(jié)構(gòu)域, Liu等[33]發(fā)現(xiàn), RXGFX(K/R)XAXXXGXX(L/V)VPXXXFG(E/ Q)是DGAT2同源蛋白中都保守的功能元件。與其他植物的DGAT2蛋白質(zhì)序列比對(duì)表明, PfDGAT2蛋白屬于DGAT2家族, 此外, 進(jìn)化分析也支持這一假設(shè), 因?yàn)镻fDGAT2與其他植物物種的DGAT2蛋白聚在一起(圖2)。PfDGAT2蛋白與芝麻SiDGAT2的親緣關(guān)系最近, 其次與煙草、馬鈴薯DGAT2蛋白親緣關(guān)系較近。前人研究中, 普遍認(rèn)為在營(yíng)養(yǎng)組織中的表達(dá)和活性高于種子, 鄭玲等[34]發(fā)現(xiàn), 煙草不同器官中都表達(dá)了花生基因, 但在柱頭和花藥中顯示出較強(qiáng)表達(dá)。He等[35]對(duì)蓖麻基因表達(dá)分析表明,在種子中的表達(dá)量比在營(yíng)養(yǎng)組織中的更高, 因此還需從不同植物中分離基因并研究其表達(dá)模式。前人對(duì)紫蘇僅研究了不同品種的種子表達(dá)模式, 沒(méi)有做深入的研究, 本試驗(yàn)從紫蘇不同組織以及種子不同發(fā)育過(guò)程2個(gè)階段做了的表達(dá)模式研究, 表明在10 d種子中表達(dá)量最高, 在15 d種子中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平(圖4), 驗(yàn)證了紫蘇中基因在種子的表達(dá)和活性高于其他組織。由于種子發(fā)育中早期是脂肪酸積累的關(guān)鍵時(shí)期, 中后期雖然的表達(dá)量逐漸下調(diào), 但TAG已經(jīng)儲(chǔ)存到了油體蛋白中, 所以轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟種子含油率顯著升高, 以上結(jié)果說(shuō)明在種子脂肪酸積累中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

有研究表明, 過(guò)表達(dá)基因可以增加油的積累和不飽和脂肪酸的合成。Bourgis等[36]和Tranbarger等[37]發(fā)現(xiàn), 過(guò)表達(dá)油棕基因使大量的油沉積在中果皮中, 提高了油棕的含油量。本研究在擬南芥中過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn), 擬南芥種子油增加了21.68%~77.89% (圖5), 說(shuō)明在種子油積累中起重要作用, 能提高種子含油量。TAG中不飽和脂肪酸的積累首先是將官能團(tuán)插入?；溨? 然后將不飽和的脂肪酸組裝到TAG。在本實(shí)驗(yàn)中, 外源基因在擬南芥中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致多不飽和脂肪酸亞麻酸、花生一烯酸、花生二烯酸和二十二一烯酸的增加, 棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和花生酸降低(圖6), 顯然對(duì)種子中亞麻酸等不飽和脂肪酸積累起著重要作用。Chen等[38]發(fā)現(xiàn),表現(xiàn)出了對(duì)不飽和脂肪酸的底物偏好性, 其中亞油酸的含量增加, 而亞麻酸的含量減少。Zheng等[27]在擬南芥中過(guò)表達(dá)椰子, 導(dǎo)致擬南芥的種子亞油酸含量顯著增加, 花生一烯酸和花生酸的比例降低, 表現(xiàn)出對(duì)亞油酸底物的偏愛(ài)。在這些研究中, 與本試驗(yàn)亞麻酸、二十二一烯酸等含量增加, 亞油酸等含量減少不同的是, 過(guò)表達(dá)大豆、椰子、油棕等植物的基因都表現(xiàn)出了亞油酸含量增加, 其他不飽和脂肪酸含量減少, 例如亞麻酸或花生一烯酸減少。這可能是因?yàn)檫@些植物的脂肪酸組分不同, 例如油棕櫚中果皮只有10%亞油酸, 不含亞麻酸[39], 而釀酒酵母不含亞油酸或不含亞麻酸[25]。紫蘇含豐富的α-亞麻酸, 因此其表現(xiàn)出對(duì)亞麻酸等組分的偏好性, 導(dǎo)致在TAG組裝過(guò)程中, 有更多的亞麻酸、花生一烯酸、花生二烯酸和二十二一烯酸組裝到TAG骨架上, 從而降低了棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和花生酸含量。

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Cloning and function analysis of a type 2 diacylglycerol acyltransferase (DGAT2) from

LU Geng, TANG Xin, LU Jun-Xing, LI Dan, HU Qiu-Yun, HU Tian, and ZHANG Tao*

College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China

Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) is a key enzyme in the final step of triacylglycerol (TAG) synthesis in plant. In seed oil of certain plants, DGAT2 can selectively accumulate more unsaturated fatty acids. In this paper, we successful clonedfromand performed bioinformatics analysis. Real-time fluorescence quantitative analysis showed thatwas expressed in different organs, with the highest in seeds at 10 d after anthesis, the medium in roots, and gradual decrement in the middle and late stages of seed. Compared with the wild-type, the oil content of seeds intransgenicwasincreased by 21.68%–77.89%. The fatty acid components of the four strains with the largest increase in seed oil content were analyzed. Compared with the control, linolenic acid (C18:3), arachidonic acid (C20:1), arachidonic acid (C20:2), docosaenoic acid (C22:1) increased significantly by 4.57%, 7.44%, 5.40%, and 0.37%, respectively. Palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), and linoleic acid (C18:2) were obviously reduced by 3.47%, 6.64%, and 4.83%, respectively. Oleic acid (C18:1) only decreased by 0.18% and arachidic acid (C20:0) by 1.91%. In conclusion thatgene can not only increase the oil content, but promote the accumulation of unsaturated fatty acids such as linolenic acid and arachidonic acid, which provides a reference and theoretical basis for studying the synthesis and accumulation of unsaturated fatty acid in plants.

diacylglycerol acyltransferase; seed oil content; unsaturated fatty acid;

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171588)和重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展項(xiàng)目(cstc2019jscx-msxm0612)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31171588) and the Chongqing Technology Innovation and Application Development Project (cstc2019jscx-msxm0612).

10.3724/SP.J.1006.2020.94192

張濤, E-mail: zht2188@126.com, Tel: 023-65910119

E-mail: 778448973@qq.com

2019-12-11;

2020-03-24;

2020-04-26.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200426.1401.004.html