劉培勛 馬小飛 萬(wàn)洪深 鄭建敏 羅江陶 蒲宗君,*

研究簡(jiǎn)報(bào)

兩個(gè)不同籽粒硬度小麥的比較蛋白組學(xué)分析

劉培勛1馬小飛2萬(wàn)洪深1鄭建敏1羅江陶1蒲宗君1,*

1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 610066;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所, 山西臨汾 041000

小麥?zhǔn)侨蚍N植面積最大糧食作物, 為全球45億人提供日常蛋白和能量攝入的20%。弄清小麥籽粒硬度遺傳基礎(chǔ), 對(duì)于改良小麥品質(zhì)具有重大意義。為探討不同硬度小麥種子的分子基礎(chǔ), 本實(shí)驗(yàn)選用西南麥區(qū)2個(gè)硬度差異極顯著的小麥品種川麥66和蜀麥969, 從蛋白水平上分析其種子蛋白差異表達(dá)情況, 利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(tandem mass tags)結(jié)合生物信息學(xué)分析, 分析差異表達(dá)的蛋白及其功能和通路等富集情況。結(jié)果表明, 鑒定并定量了有效蛋白6020個(gè), 其中顯著差異表達(dá)蛋白113個(gè), 在軟質(zhì)麥川麥66中上調(diào)表達(dá)的69個(gè), 下調(diào)表達(dá)的44個(gè)。差異蛋白GO富集分析共富集到65個(gè)GO條目, 達(dá)到極顯著富集水平的包括生物過(guò)程的1個(gè)條目、細(xì)胞組成的1個(gè)條目和分子功能的6個(gè)條目。推測(cè)營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)蛋白、酶抑制劑活性類(lèi)蛋白和谷胱甘肽代謝途徑類(lèi)蛋白可能參與小麥籽粒硬度形成。籽粒硬度相關(guān)蛋白可能主要分布于細(xì)胞胞外區(qū), 具有防御作用。從系統(tǒng)發(fā)育分析推測(cè), puroindolines蛋白及其同源蛋白, 可能既作為小麥籽粒貯藏蛋白, 同時(shí)還能作為酶抑制劑調(diào)控籽粒發(fā)育。本研究為進(jìn)一步探索小麥籽粒硬度遺傳機(jī)制提供了參考。

小麥; 籽粒硬度; TMT; 蛋白質(zhì)組

小麥硬度是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)和影響小麥最終用途的重要性狀指標(biāo)。硬質(zhì)小麥適用于制作面包和面條等, 軟質(zhì)小麥適用于制作餅干、糕點(diǎn)和釀酒等, 西南地區(qū)釀酒企業(yè)較多, 酒曲以及釀酒過(guò)程對(duì)軟質(zhì)小麥的需求較大。弄清小麥硬度遺傳基礎(chǔ), 對(duì)于改良小麥品質(zhì), 培育滿(mǎn)足不同需要的小麥品種具有重大意義。

小麥籽粒硬度與蛋白質(zhì)含量高度相關(guān), 硬質(zhì)小麥蛋白質(zhì)含量比軟質(zhì)小麥高, 且在小麥籽粒中蛋白質(zhì)和淀粉以水溶性糖蛋白方式緊密結(jié)合。因此, 籽粒硬度與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量呈顯著正相關(guān)[1]。硬質(zhì)、高蛋白常被看作是強(qiáng)筋小麥的標(biāo)志, 而軟質(zhì)、低蛋白則被作為評(píng)價(jià)弱筋小麥的依據(jù)[2]。小麥種子蛋白主要由麥谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白組成, 其中谷蛋白和醇溶蛋白共同構(gòu)成種子貯藏蛋白。李碩碧等利用掃描電鏡觀察了小麥籽粒的斷面, 發(fā)現(xiàn)軟質(zhì)品種的淀粉近似球形, 清晰可見(jiàn); 硬麥品種籽粒的斷面則很少見(jiàn)到完整淀粉粒, 破碎淀粉粒較多, 胚乳結(jié)構(gòu)相對(duì)致密[3]。

普通小麥籽粒硬度由主效基因控制[4],分為和兩種類(lèi)型, 位于5D染色體短臂上, 二者高度同源且緊密連鎖。軟質(zhì)對(duì)硬質(zhì)為顯性, 當(dāng)2個(gè)基因同時(shí)存在時(shí), 小麥籽粒表現(xiàn)為軟質(zhì), 當(dāng)缺失或發(fā)生變異時(shí), 小麥籽粒表現(xiàn)為硬質(zhì), 能夠解釋60%左右的變異[5]。和均編碼148個(gè)氨基酸序列, 其氨基酸同源性約60%, 分子量約為13 kD。研究發(fā)現(xiàn), 這種蛋白只存在于種子的胚乳細(xì)胞中, 而在其他組織中沒(méi)有[6]。隨著對(duì)認(rèn)識(shí)的逐步加深, 發(fā)現(xiàn)其除了調(diào)節(jié)籽粒硬度之外, 還具有一定的抗病性[7]。

與硬度相關(guān)的()基因與基因共同存在于5DS染色體上, 且高度同源, 但研究表明其對(duì)籽粒硬度影響不顯著[8]。Wilkinson等[9]在小麥cDNA中發(fā)現(xiàn)一種與核苷酸序列相似性高達(dá)70%的類(lèi)基因, 稱(chēng)為, 對(duì)籽粒硬度存在一定影響, Chen等[10]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該基因有多種變異類(lèi)型。隨著基因組學(xué)的發(fā)展, 研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的貯藏蛋白基因, 其所表達(dá)的蛋白與燕麥蛋白相似, 為小麥品質(zhì)的改良提供了參考[11-12]。Furtadoet等[13]在小麥種子中發(fā)現(xiàn)一類(lèi)新的基因(), 對(duì)面筋質(zhì)量、強(qiáng)度和延伸性有顯著影響[14]。對(duì)puroindoline同源蛋白家族分析發(fā)現(xiàn), gsp-l、puroindolineb- 2、avenin like b蛋白與puroindoline同屬于超級(jí)家族, 推測(cè)除puroindoline外, 存在其他基因, 尤其是其同源基因, 也對(duì)籽粒硬度起作用[15]。

目前, 對(duì)于小麥籽粒硬度的研究主要集中于基因(和), 但該基因尚不能完全解釋小麥籽粒硬度變異的機(jī)制[16-17]。本研究利用TMT (tandem mass tags)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù), 結(jié)合小麥最新基因組(iwgsc_refseqv1.0 2018)注釋信息[18]和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[19], 快速高通量地鑒定2個(gè)不同籽粒硬度小麥種子中蛋白差異表達(dá)情況, 并通過(guò)生物信息學(xué)分析, 對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能和通路等富集分析, 以期挖掘影響籽粒硬度的潛在的新基因, 為小麥品質(zhì)改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

四川主推小麥品種川麥66 (系譜: 川麥42/98-226// 01-3570)是西南地區(qū)筋力最弱、硬度最低的品種之一[20], 蜀麥969 (SHW-L1/SW8188//川育18/3/川麥42)是四川主推品種中筋力最強(qiáng)、硬度最高的品種之一[21], 兩者都是川麥42的衍生品種, 其親緣關(guān)系相對(duì)較近。2018年10月至2019年5月將其種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院德陽(yáng)試驗(yàn)基地(31°14′N(xiāo), 104°24′E), 3個(gè)重復(fù), 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 每個(gè)小區(qū)行長(zhǎng)1.5 m, 行距0.3 m, 共10行。播種時(shí)各施75 kg hm?2的磷肥(過(guò)磷酸鈣)和鉀肥(硫酸鉀)作為基肥, 氮肥施尿素150 kg hm?2, 分2次施用, 一半基施, 另一半作拔節(jié)肥。收取成熟小麥籽粒(含水量12%), 進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)和蛋白表達(dá)分析。使用單粒谷物測(cè)定儀KSCS4100檢測(cè)小麥籽粒硬度指數(shù), 使用近紅外谷物品質(zhì)分析儀Infratec 1241檢測(cè)粗蛋白含量、濕面筋含量和淀粉含量。

1.2 種子蛋白提取

將冷凍的種子樣品低溫研磨成粉, 加入蛋白裂解液(100 mmol L?1碳酸氫銨、6 mol L?1尿素、0.2%SDS, pH 8.0)充分裂解, 然后在4℃下12,000′離心15 min, 取上清液, 加入終濃度10 mmol L?1DTTred于56℃反應(yīng)1 h, 再加入足量IAM, 于室溫避光反應(yīng)1 h。加入4倍體積的?20℃預(yù)冷丙酮, 于?20℃條件下沉淀2 h, 最后在4℃下12,000′離心15 min, 收集沉淀。經(jīng)重懸清洗后, 加入適量蛋白溶解液(6 mol L?1尿素、100 mmol L?1TEAB, pH 8.5)溶解蛋白沉淀。使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白濃度。

1.3 TMT標(biāo)記和液質(zhì)檢測(cè)

2個(gè)品種, 3次重復(fù), 共6個(gè)蛋白樣品經(jīng)酶切與除鹽[22]后, 分別加入0.1 mol L?1TEAB緩沖液和乙腈溶解的含不同同位素標(biāo)簽的TMT (Tandem Mass Tags)標(biāo)記[23]試劑, 室溫下顛倒混勻反應(yīng)2 h。加入終濃度8%氨水終止反應(yīng), 取等體積標(biāo)記后的樣品混合, 除鹽后凍干。使用L-3000HPLC系統(tǒng)進(jìn)行餾分分離, 每分鐘收集1管, 合并為10個(gè)餾分, 凍干后各加入0.1%甲酸溶解。使用EASY-nLCTM1200納升級(jí)UHPLC系統(tǒng), 進(jìn)行液相色譜檢測(cè)。使用QExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀, NanosprayFlex ESI)離子源, 數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè), 設(shè)一級(jí)質(zhì)譜分辨率為60,000 (200 m z?1)。選取全掃描中離子強(qiáng)度TOP40的母離子使用高能碰撞裂解(HCD)方法碎裂, 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè), 設(shè)二級(jí)質(zhì)譜分辨率為15,000 (200 m z?1), 最終生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)(.raw)。

1.4 蛋白鑒定

合并UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[19]和最新小麥基因組[18]注釋文件IWGSC RefSeq v1.0 annotation (154,254 sequences)作為最終的搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。利用Proteome Discoverer 2.2軟件對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)一步過(guò)濾: 可信度在99%以上的譜肽為可信PSMs (peptide spectrum matches), 至少包含一個(gè)unique肽段(特有肽段)的蛋白為可信蛋白, 只保留可信的譜肽和蛋白, 通過(guò)FDR驗(yàn)證, 去除掉FDR大于1%的肽段和蛋白。對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行蛋白注釋, 包括GO注釋[24]、KEGG注釋[25]、COG注釋[26]和結(jié)構(gòu)域注釋(IPR)[27]。

1.5 蛋白定量分析和差異表達(dá)蛋白功能分析

根據(jù)原始下機(jī)的譜圖峰面積可以得到各個(gè)樣品中每個(gè)PSM的相對(duì)定量值, 后再根據(jù)鑒定出的Unique肽段中所包含所有PSM的定量信息校正得到Unique肽段的相對(duì)定量值, 最后根據(jù)每個(gè)蛋白質(zhì)包含的所有Unique肽段的定量信息校正得到每個(gè)蛋白的相對(duì)定量值。將每個(gè)蛋白在比較樣品對(duì)中的所有生物重復(fù)定量值的均值的比值作為差異倍數(shù)(Fold Change, FC)。將每個(gè)蛋白在樣品中的相對(duì)定量值進(jìn)行-test檢驗(yàn),值作為顯著性指標(biāo)。當(dāng)FC≥1.5, 且≤0.05時(shí), 蛋白表現(xiàn)為表達(dá)量上調(diào), 當(dāng)FC≤0.67, 同時(shí)≤0.05時(shí), 蛋白表現(xiàn)為表達(dá)量下調(diào)。針對(duì)篩選出來(lái)的差異蛋白進(jìn)行GO、KEGG功能富集分析, 與所有鑒定到的蛋白背景相比, 應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)計(jì)算值, 以≤0.05為閾值, 滿(mǎn)足此條件的條目(或路徑)定義為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的條目(或路徑)。

1.6 差異表達(dá)蛋白與puroindolines蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

前人對(duì)于小麥籽粒硬度的研究主要集中于基因(和), 該蛋白主要在軟質(zhì)麥中存在和表達(dá)。從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)下載小麥Pina和Pinb蛋白。將本研究中鑒定出的在軟質(zhì)麥川麥66中較硬質(zhì)麥?zhǔn)覃?69中顯著上調(diào)表達(dá)的蛋白與puroindolines蛋白一起, 利用Clustal X 2.0進(jìn)行序列比對(duì), 利用MEGA 7.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 分析差異表達(dá)蛋白與puroindolines蛋白的同源關(guān)系[28]。

OLI 理論視角下珠三角港臺(tái)資企業(yè)空間特征演變及影響機(jī)制研究 馬 星 黎智楓 張 澤 等2018/04 117

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)小麥籽粒樣品質(zhì)分析

經(jīng)檢測(cè)，川麥66的平均籽粒硬度指數(shù)為25.2，蜀麥969的平均籽粒硬度指數(shù)為40.2。籽粒粗蛋白含量、濕面筋含量和淀粉含量檢測(cè)主要結(jié)果見(jiàn)圖1，川麥66的籽粒硬度指數(shù)、粗蛋白含量和濕面筋含量均低于蜀麥969, 淀粉含量則高于蜀麥969, 經(jīng)檢驗(yàn), 差異均達(dá)到顯著水平。

2.2 蛋白鑒定

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索, 鑒定到二級(jí)譜圖(total spectra)數(shù)量為85,497個(gè), 肽段(Peptide)數(shù)為32,552個(gè), 蛋白數(shù)(protein)為6061個(gè)。利用GO、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋, 利用Pfam、ProDom、SMART等結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域注釋(IPR), 利用模式結(jié)構(gòu)或特征進(jìn)行功能未知蛋白的結(jié)構(gòu)域注釋, 共注釋到6020個(gè)蛋白, 注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2, 有2819個(gè)蛋白可同時(shí)被４種數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。

圖1 川麥66和蜀麥969籽粒主要品質(zhì)指標(biāo)比較

圖2 蛋白質(zhì)功能注釋結(jié)果

2.3 差異表達(dá)蛋白

根據(jù)限制條件篩選的差異表達(dá)蛋白(DEP), 在注釋到的6020個(gè)蛋白中, 對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對(duì)數(shù), 將值以10為底取對(duì)數(shù)的絕對(duì)值, 做出火山圖, 觀察不同蛋白在不同樣品間比較時(shí)的上調(diào)、下調(diào)情況, 結(jié)果見(jiàn)圖3。2個(gè)樣品差異表達(dá)蛋白(DEP)總數(shù)為113, 其中軟質(zhì)麥川麥66中較硬質(zhì)麥?zhǔn)覃?69中顯著上調(diào)的蛋白為69個(gè), 顯著下調(diào)的蛋白為44個(gè)。

2.4 差異蛋白GO富集分析

GO顯著性富集分析能分析差異蛋白行使的主要生物學(xué)功能。2個(gè)小麥樣品中, 表達(dá)差異顯著的113個(gè)蛋白經(jīng)GO富集分析, 富集到65個(gè)GO條目中, 去除僅包含1個(gè)差異蛋白的條目, 剩余33個(gè)可靠GO條目。其中, 達(dá)到顯著富集(<0.05)水平的GO條目為10個(gè), 屬于生物過(guò)程1個(gè), 細(xì)胞組分1個(gè), 分子功能的8個(gè)(圖4)。達(dá)到極顯著富集(<0.01)水平的條目為8個(gè), 生物過(guò)程條目有1個(gè), 為防御反應(yīng)過(guò)程(defense response); 細(xì)胞組分條目有1個(gè), 為胞外區(qū)(extracellular region); 分子功能條目有6個(gè), 包括營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性(nutrient reservoir activity)、酶抑制劑活性(enzyme inhibitor activity)、酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性(serine-type endopeptidase inhibitor activity)、肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性(endopeptidase inhibitor activity)和天冬氨酸型內(nèi)肽酶活性類(lèi)(aspartic-type endopeptidase activity)。

圖3 差異表達(dá)蛋白火山圖

圖4 GO富集柱狀圖

A屬于生物過(guò)程(BP), B屬于細(xì)胞組分(CC), C、D、E、F、G、H、I、J屬于分子功能(MF)。A: 防御反應(yīng); B: 胞外區(qū); C: 營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性; D: 酶抑制劑活性; E: 酶調(diào)節(jié)活性; F: 絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性; G: 肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性; H: 天冬氨酸型內(nèi)肽酶活性; I: 電子載體活性; J: 幾丁質(zhì)結(jié)合。

A belongs to BP (biological process), B belongs to CC (cellular component), C, D, E, F, G, H, I, J belong to MF (molecular function). A: defense response; B: extracellular region; C: nutrient reservoir activity; D: enzyme inhibitor activity; E: enzyme regulator activity; F: serine-type endopeptidase inhibitor activity; G: endopeptidase inhibitor activity; H: aspartic-type endopeptidase activity; I: electron carrier activity; J: chitin binding.

達(dá)到極顯著富集水平的分子功能類(lèi)的6個(gè)GO條目, 有1個(gè)為營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性, 其余5個(gè)條目均涉及酶抑制劑活性。營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性條目中包含16個(gè)差異表達(dá)蛋白(表1), 其中在川麥66中顯著上調(diào)表達(dá)的有7個(gè), 下調(diào)表達(dá)的9個(gè)。該類(lèi)別中包含的蛋白主要有低分子谷蛋白亞基、燕麥相似蛋白、α和γ-醇溶蛋白及萌發(fā)素類(lèi)蛋白。5個(gè)涉及酶抑制劑活性的條目中, 多個(gè)蛋白均同時(shí)屬于不同的GO條目。經(jīng)整理, 屬于酶抑制劑活性類(lèi)的差異表達(dá)蛋白共15個(gè), 包括α-淀粉酶、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)化酶、糜蛋白酶等(表2)。其中, 10個(gè)蛋白在川麥66中顯著上調(diào)表達(dá), 5個(gè)下調(diào)表達(dá), puroindoline b蛋白富集于該類(lèi)別中, 在川麥66中較蜀麥969差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到2.8倍。

2.5 差異蛋白KEGG富集分析

2.6 上調(diào)表達(dá)蛋白與puroindolines蛋白同源關(guān)系分析

將提取出的69個(gè)在軟質(zhì)麥川麥66中顯著上調(diào)表達(dá)的蛋白與從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)下載的小麥puroindolines蛋白(puroindoline a和puroindoline b)共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)。對(duì)屬于營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)別、酶抑制劑活性類(lèi)別和谷胱甘肽代謝途徑的蛋白分別用空心正方形、三角形和圓形標(biāo)記?？梢?jiàn), 7個(gè)營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)蛋白在進(jìn)化樹(shù)中, 與puroindolines蛋白聚到一起; 10個(gè)酶抑制劑活性類(lèi)蛋白中有4個(gè)與puroindolines蛋白聚到一起; 谷胱甘肽代謝類(lèi)蛋白則沒(méi)有與puroindolines蛋白聚到一起。

3 討論

本研究中所用2個(gè)硬度差異較大的品種, 都是來(lái)自西南麥區(qū), 并且是同一個(gè)親本的衍生品種, 其親緣關(guān)系較近, 一定程度上可以排除不同麥區(qū)品種之間對(duì)習(xí)性、抗性的差異以及部分遺傳背景的差異。通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)TMT標(biāo)記結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物信息學(xué)分析, 共鑒定出6020個(gè)蛋白, 在2個(gè)不同籽粒硬度小麥種子中表達(dá)差異顯著的蛋白113個(gè), 69個(gè)蛋白在川麥66中高表達(dá), 44個(gè)蛋白在蜀麥969中高表達(dá)。鑒定的蛋白數(shù)量和差異表達(dá)蛋白數(shù)量均較高, 證明TMT技術(shù)是一種高通量高分辨率的蛋白定量檢測(cè)技術(shù)[29]。

表1 營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)相關(guān)差異表達(dá)蛋白(川麥66 vs.蜀麥969)

表2 酶抑制劑類(lèi)相關(guān)差異表達(dá)蛋白(川麥66 vs.蜀麥969)

表3 谷胱甘肽代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)蛋白(川麥66 vs.蜀麥969)

圖5 軟質(zhì)麥中上調(diào)表達(dá)蛋白與puroindolines蛋白共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

帶實(shí)心圓形的為puroindolines蛋白; 帶空心正方形的為營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)別; 帶空心三角形的為酶抑制劑活性類(lèi)別; 帶空心圓形的為谷胱甘肽代謝途徑蛋白。

The proteins with solid circles are puroindolines, the proteins with squares belong to nutrient reservoir activity category, the proteins with triangles belong to enzyme inhibitor activity category, and the proteins with circles belong to glutathione metabolism category.

通過(guò)GO富集方法, 2個(gè)樣品中表達(dá)差異顯著的蛋白, 極顯著富集到生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能類(lèi)別的數(shù)量分別為1、1和6個(gè)。1個(gè)生物過(guò)程條目為防御反應(yīng)類(lèi)別, 1個(gè)細(xì)胞組分條目為胞外區(qū)類(lèi)別。推測(cè)小麥籽粒硬度相關(guān)蛋白與小麥抗逆反應(yīng)有關(guān), 可能主要分布于細(xì)胞胞外區(qū)。Kim等研究表明, 影響小麥籽粒硬度最重要的蛋白puroindolines具有抗菌作用[30-32], 與本研究推測(cè)硬度相關(guān)蛋白參與抗逆作用可互為支撐。6個(gè)分子功能類(lèi)GO條目中,值最小的條目為營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)別, 另外5個(gè)均與酶抑制劑活性相關(guān)。

營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)別, 主要是低分子谷蛋白和醇溶蛋白等貯藏蛋白, 是小麥種子的重要結(jié)構(gòu)組成成分。貯藏蛋白的種類(lèi)和表達(dá)量, 決定著小麥種子中蛋白的含量和組成, 從而影響小麥硬度。酶抑制劑類(lèi)蛋白對(duì)硬粒的影響目前未見(jiàn)專(zhuān)門(mén)報(bào)道。以puroindolines蛋白為例, 該蛋白具有α-淀粉酶抑制劑功能, 假設(shè)puroindolines高表達(dá)可有效抑制α-淀粉酶, 從而防止種子中淀粉水解。由此, 可解釋軟質(zhì)小麥中淀粉粒較完整、近似球形, 而硬質(zhì)小麥淀粉粒破壞嚴(yán)重、胚乳結(jié)構(gòu)致密[3]。硬質(zhì)麥中, 蛋白質(zhì)和淀粉以水溶性糖蛋白方式緊密結(jié)合[1], 可能與缺少淀粉酶抑制劑, 造成淀粉表面水解成糖有關(guān)。不管是營(yíng)養(yǎng)庫(kù)類(lèi)別還是酶抑制劑類(lèi)別, 均有部分蛋白相對(duì)表達(dá)量與籽粒柔軟度呈正相關(guān), 另一部分則為負(fù)相關(guān), 其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)KEGG Pathway顯著性富集分析, 富集到26個(gè)生化代謝途徑, 其中只有3個(gè)途徑達(dá)到顯著富集水平, 其中谷胱甘肽代謝途徑達(dá)到極顯著富集水平, 推測(cè)相關(guān)蛋白對(duì)籽粒硬度有一定的作用。TraesCS3A01G 488200.1、TraesCS3B01G536100.1和TraesCS3D01G 445400.1蛋白描述均為谷胱甘肽轉(zhuǎn)化酶, 且分別位于3A、3B和3D染色體, 應(yīng)該是分布于3號(hào)染色體群的同源基因。但之前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道, 其影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

基因(和)目前被認(rèn)為是影響小麥籽粒硬度的最主要基因, 但尚不能完全解釋小麥籽粒硬度變異機(jī)制[16,33]。經(jīng)序列比對(duì)和查閱小麥基因組瀏覽器(JBrowse)[34], TraesCS5D01G004100.1和TraesCS5D01G 004300.1分別就是Pina和Pinb蛋白, 該實(shí)驗(yàn)中puroindolines蛋白在軟質(zhì)麥中顯著高表達(dá), 與前人研究結(jié)果一致[35]。將puroindolines蛋白與川麥66中顯著上調(diào)表達(dá)的蛋白共同構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 7個(gè)營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)蛋白和4個(gè)酶抑制劑蛋白與puroindolines蛋白聚為一類(lèi)?？梢?jiàn), 從蛋白序列同源性角度, 營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)蛋白和部分酶抑制劑類(lèi)蛋白與puroindolines蛋白有著高度同源性, 可視為同一蛋白家族成員, 因此與puroindolines蛋白具有相似的分子功能。某些小麥籽粒貯藏蛋白, 可能兼具酶抑制劑功能。

[1] Bakhella M, Hoseney R C, Lookhart G L. Hardness of Moroccan wheats., 1990, 67: 246–250.

[2] 吳宏亞, 蔣正寧, 王玲, 程順和. 小麥籽粒硬度及其對(duì)面粉加工品質(zhì)影響的研究進(jìn)展. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2014, 30: 437–441. Wu H Y, Jiang Z N, Wang L, Cheng S H. Research progress in wheat kernel hardness and its effect on milling quality., 2014, 30: 437–441 (in Chinese with English abstract).

[3] 李碩碧. 小麥籽粒胚乳結(jié)構(gòu)性狀的研究. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2002, 30(5): 7–10. Li S B. Study on structural characters of grain endosperm of wheat.(Nat Sci Edn), 2002, 30(5): 7–10 (in Chinese with English abstract).

[4] Giroux M J, Morris C F. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b., 1998, 95: 6262–6266.

[5] Mods C F. Puroindolines: the molecular genetic basis of wheat grain hardness., 2002, 48: 633–647.

[6] Wiley P R, Tosi P, Evrard A, Lovegrove A, Jones H D, Shewry P R. Promoter analysis and immunolocalisation show that puroindoline genes are exclusively expressed in starchy endosperm cells of wheat grain., 2007, 64: 125–136.

[7] 陳鋒, 董中東, 程西永, 詹克慧, 許海霞, 崔黨群. 小麥puroindoline及其相關(guān)基因分子遺傳基礎(chǔ)研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43: 1108–1116. Chen F, Dong Z D, Cheng X Y, Zhan K H, Xu H X, Cui D Q. Advances in research of molecular genetics of puroindoline and its related genes in wheat., 2010, 43: 1108–1116 (in Chinese with English abstract)

[8] Gollan P, Smith K, Bhave M.genes comprise a multigene family in wheat that exhibits a unique combination of sequence diversity yet conservation., 2007, 45: 184–198.

[9] Wilkinson M, Wan Y, Tosi P, Leverington M, Snape J, Mitchell R A C, Shewry P R. Identification and genetic mapping of variant forms of puroindoline b expressed in developing wheat grain., 2008, 48: 722–728.

[10] Chen F, Beecher B S, Morris C F. Physical mapping and a new variant of puroindolinegenes in wheat., 2010, 120: 745–751.

[11] Anderson O D, Hsia C C, Adalsteins A E, Lew E L, Kasarda D D. Identification of several new classes of low-molecular-weight wheat gliadin-related proteins and genes., 2001, 103: 307–315.

[12] Zhang Y, Hu X, Islam S, She M, Peng Y, Yu Z, Zhang J. New insights into the evolution of wheat avenin-like proteins in wild emmer wheat ()., 2018, 115: 13312–13317.

[13] Furtado A, Bundock P C, Banks P M, Fox G, Yin X, Henry R J. A novel highly differentially expressed gene in wheat endosperm associated with bread quality., 2015, 5:10446.

[14] Guzmán C, Xiao Y, Crossa J, González-Santoyo H, Huerta J, Singh R, Dreisigacker S. Sources of the highly expressed wheat bread making (wbm) gene in CIMMYT spring wheat germplasm and its effect on processing and bread-making quality., 2016, 209: 689–692.

[15] 劉培勛, 萬(wàn)洪深, 鄭建敏, 羅江陶, 蒲宗君. 小麥基因家族的鑒定及表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 53(12): 2321–2330. Liu P X, Wan H S, Zheng J M, Luo J T, Pu Z J. Genome-wide identification and expression analysis ofgenes family in wheat.,2020, 53(12): 2321–2330 (in Chinese with English abstract).

[16] Ayala M, Guzmán C, Pe?a R J, Alvarez J B. Genetic diversity and molecular characterization of puroindoline genes (and) in bread wheat landraces from Andalusia (Southern Spain)., 2016, 71: 61–65.

[17] Chen M, Wilkinson M, Tosi P, He G, Shewry P. Novel puroindoline and grain softness protein alleles inspecies with the C, D, S, M and U genomes., 2005, 111: 1159–1166.

[18] Alaux M, Rogers J, Letellier T, Flores R, Alfama F, Pommier C, Guerche C. Linking the international wheat genome sequencing consortium bread wheat reference genome sequence to wheat genetic and phenomic data., 2018, 19: 111.

[19] UniProt: the universal protein knowledgebase., 2016, 45: D158–D169.

[20] 鄭建敏, 蒲宗君. 白皮優(yōu)質(zhì)弱筋小麥新品種川麥 66. 四川農(nóng)業(yè)科技, 2015, (2): 24–24. Zheng J M, Pu Z J. Chuanmai 66, a new white wheat variety with high quality and soft grain., 2015, (2): 24–24 (in Chinese).

[21] 蔣進(jìn), 王淑榮, 張連全, 劉利, 馮曉, 左娟. 四川省 “十二五” 期間育成小麥新品種的品質(zhì)分析. 種子, 2017, 36(2): 95–99. Jiang J, Wang S R, Zhang L Q, Liu L, Feng X, Zuo J. Quality analysis of wheat varieties released in Sichuan province during the 12th Five-Year Plan., 2017, 36(2): 95–99 (in Chinese).

[22] Wu J, An Y, Pu H, Shan Y, Ren X, An M, Ji J. Enrichment of serum low-molecular-weight proteins using C18 absorbent under urea/dithiothreitol denatured environment., 2010, 398: 34–44.

[23] Thompson A, Sch?fer J, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Hamon C. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS., 2003, 75: 1895–1904.

[24] Ashburner M, Ball C A, Blake J A, Botstein D, Butler H, Cherry J M, Harris M A. Gene ontology: tool for the unification of bio-logy., 2000, 25: 25–29.

[25] Kanehisa M, Goto S, Hattori M, Aoki-Kinoshita K F, Itoh M, Kawashima S, Hirakawa M. From genomics to chemical genomics: new developments in KEGG., 2006, 34: 354–357.

[26] Tatusov R L, Fedorova N D, Jackson J D, Jacobs A R, Kiryutin B, Koonin E V, Rao B S. The COG database: an updated version includes eukaryotes., 2003, 4: 41.

[27] Finn R D, Attwood T K, Babbitt P C, Bateman A, Bork P, Bridge A J, Gough J. InterPro in 2017: beyond protein family and domain annotations., Jan 2017; doi: 10.1093/ nar/gkw1107.

[28] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets., 2016, 33: 1870.

[29] 宋奇琦, Pratiksha SINGH, Rajesh Kumar SINGH, 宋修鵬, 李海碧, 農(nóng)友業(yè), 楊麗濤, 李楊瑞. 基于iTRAQ技術(shù)的甘蔗受黑穗病菌侵染蛋白組分析. 作物學(xué)報(bào), 2019, 45: 55–69. Song Q Q, Pratiksha S, Rajesh K S, Song X P, Li H B, Nong Y Y, Yang L T, Li Y R. Proteomic analysis of sugarcane-interaction based on iTRAQ technique., 2019, 45: 55–69.

[30] Kim K H, Feiz L, Dyer A T, Grey W, Hogg A C, Martin J M, Giroux M J. Increased resistance toseed rot in transgenic wheat over-expressing puroindolines., 2012, 160: 243–247.

[31] Dhatwalia V K, Sati O P, Tripathi M K, Kumar A. Puroindoline: antimicrobial wheat endosperm specific protein., 2011, 7: 903–906.

[32] Phillips R L, Palombo E A, Panozzo J F, Bhave M. Puroindolines, Pin alleles, hordoindolines and grain softness proteins are sources of bactericidal and fungicidal peptides., 2011, 53: 112–117.

[33] Nirmal R C, Furtado A, Wrigley C, Henry R J. Influence of gene expression on hardness in wheat., 2016, 11: e0164746.

[34] Skinner M E, Uzilov A V, Stein L D, Mungall C J, Holmes I H. Jbrowse: a next-generation genome browser., 19: 1630–1638.

[35] Li Y, Mao X, Wang Q, Zhang J, Li X, Ma F, Sun F, Chang J, Chen M, Wang Y, Li K, Yang G X, He G. Overexpression of puroindoline agene in transgenic durum wheat (ssp.) leads to a medium-hard kernel texture., 2014, 33: 545–554.

Comparative proteomic analysis of two wheat genotypes with contrasting grain softness index

LIU Pei-Xun1, MA Xiao-Fei2, WAN Hong-Shen1, ZHENG Jian-Min1, LUO Jiang-Tao1, and PU Zong-Jun1,*

1Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Southwestern China, Ministry of Agriculture and Rural Areas, Chengdu 610066, Sichuan, China;2Wheat Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Linfen 041000, Shanxi, China

Wheat is the crop most widely grown in the world and provides the daily protein and 20% food calories for 4.5 billion people. It is crucial to understand the genetic basis of grain hardness for improving wheat quality. In order to explore the molecular basis of the formation of wheat grain hardness, two wheat cultivars Chuanmai 66 and Shumai 969 with significant hardness difference in southwest wheat region were selected to analyze the proteins differential expression by TMT quantitative proteomics (tandem mass tags) and bioinformatic methods of function and pathway enrichment analysis. A total of 6020 effective proteins were identified and quantified, including 113 differentially expressed proteins (DEPs), of which 69 were up-regulated and 44 were down-regulated in soft wheat Chuanmai 66. These DEPs were enriched into 65 GO terms, including a biological process term, a cellular component term and six molecular function terms at extremely significant level. Based on the enrichment analysis, we suggested that nutrient reservoir activity proteins, enzyme inhibitor proteins and glutathione metabolism proteins might participate in the formation of wheat grain hardness, and grain hardness related proteins might mainly distribute in the extracellular region of cells and had defensive function. According to the phylogenetic analysis, it was inferred that puroindolines and its homologous proteins might be as not only wheat grain storage proteins, but also enzyme inhibitors regulating grain development. This study provides a basis for further exploring the genetic mechanism of wheat grain hardness.

L; grain hardness; TMT; protemics

10.3724/SP.J.1006.2020.91068

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31671683, 31401383), 四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程(2016ZYPZ-016, 2019QNJJ-007, 2019QYXK034)和四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017JY0077)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31671683, 31401383), the Financial Innovation Capacity Improvement Project of Sichuan Province (2016ZYPZ-016, 2019QNJJ-007, 2019QYXK034), and the Science and Technology Planning Project of Sichuan Province (2017JY0077).

蒲宗君, E-mail: pzjun68@163.com

E-mail: littlefarmer@163.com; Tel: 028-84504231

2019-11-23;

2020-03-30;

2020-04-26.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200426.1402.006.html