林 蓁，楊文圣

EB病毒(EB virus, EBV)，全世界約95%的成人攜帶此病毒，其與許多腫瘤性疾病及非腫瘤性疾病關(guān)系密切，其中EBV相關(guān)淋巴組織疾病更是病理診斷中較為困難的領(lǐng)域。EB病毒檢測不同方法可能檢測結(jié)果會(huì)有所差異，我們選擇原位雜交方法，其主要優(yōu)點(diǎn)在于原位，可以對(duì)靶序列進(jìn)行組織、細(xì)胞的空間定位。原位雜交檢測具有敏感性高、特異性強(qiáng)、定位清晰，是目前較公認(rèn)檢測EBV的金標(biāo)準(zhǔn)。如何在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件，做好質(zhì)控顯得十分必要。本科室對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良，節(jié)省了檢測時(shí)間，實(shí)驗(yàn)效果更佳，結(jié)果更加穩(wěn)定，現(xiàn)分享如下。

1 材料與方法

1.1 材料隨機(jī)選取2017年1月～2019年1月送廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院病理科檢測EBER的組織90例。

1.2 試劑與儀器EBER試劑盒(泰普生物中國公司)、EDTA組織修復(fù)液(pH 9.0，Dako公司)、PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)、全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理儀(PT200，Dako公司)、電熱恒溫箱、徠卡切片機(jī)。

1.3 方法(1)切片與脫蠟：石蠟組織3 μm厚切片，黏附2張潔凈防脫載玻片上均分2組，65 ℃烤片30 min。二甲苯3 min×2，無水乙醇3 min×2，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，流水3 min。(2)預(yù)處理、變性、雜交：①傳統(tǒng)方法，預(yù)處理、變性、雜交：蛋白酶K消化5 min、55 ℃孵育變性60 min、37 ℃恒溫雜交過夜。②改良方法，預(yù)處理：將EDTA(50×)修復(fù)液裝入全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理儀中，開啟預(yù)處理程序加熱預(yù)溫到85 ℃后，將切片浸沒入修復(fù)液中，繼續(xù)預(yù)處理程序，進(jìn)行98 ℃ 20 min的組織滲透；程序結(jié)束，取出切片PBS緩沖液3 min，蒸餾水1 min；變性、雜交：根據(jù)組織大小移液15～20 μL適量雜交液，加潔凈蓋玻片覆蓋組織切面。切片水濕盒55 ℃恒溫孵育變性60 min取出；放置裝雜交增強(qiáng)液的孵育盒，37 ℃恒溫雜交60 min。(3)免疫顯色、切片復(fù)染：切片小心移去蓋玻片，放置加熱至48～50 ℃ PBS緩沖液2 min×3，充分搖蕩，拭去組織周邊緩沖液，滴加一抗50 μL，37 ℃水濕盒孵育30 min；取出切片37 ℃ PBS緩沖液3 min×2，充分搖蕩。拭去組織周邊緩沖液，滴加二抗50 μL，室溫孵育20 min；取出切片PBS緩沖液2 min×3，充分搖蕩。拭去組織周邊緩沖液，滴加HRP 50 μL，室溫水濕盒孵育30 min；取出切片，PBS緩沖液2 min×3，充分搖蕩。拭去組織周邊緩沖液，滴加適量新鮮配置DAB顯色2 min左右，顯微鏡下控制時(shí)間。切片蘇木精適度復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀，組織細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯棕褐色顆粒即判為陽性，未出現(xiàn)棕褐色顆粒判為陰性。

2 結(jié)果

90例檢測EBER組織中，傳統(tǒng)方法陽性檢出37例、陰性53例；改良方法陽性檢出39例、陰性51例(表1)。兩組檢測陰性、陽性結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.763)。改良方法：陰性病例背景干凈無表達(dá)，陽性病例信號(hào)表達(dá)強(qiáng)、明顯清晰(圖1)；陽性信號(hào)拷貝數(shù)少信號(hào)弱的病例，陽性信號(hào)仍清晰可辨(圖2)。

表1 改良與傳統(tǒng)原位雜交檢測EBER結(jié)果對(duì)比[n(%)]

①②

3 討論

原位雜交方法檢測石蠟包埋組織中EBER，對(duì)組織進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理，使組織通透性增強(qiáng)，易于已知標(biāo)記探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與待測靶mRNA雜交，操作中存在各種影響因素，想要做好質(zhì)控，組織滲透環(huán)節(jié)十分關(guān)鍵。傳統(tǒng)方法常首選蛋白酶K，亦有選擇胃酶增強(qiáng)組織通透性的[1]，這種廣泛去蛋白作用在增強(qiáng)組織通透性和核酸探針穿透性，提高雜交信號(hào)的同時(shí)，也會(huì)使靶核酸減少，對(duì)組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)也有一定的影響，所以在通透組織的試劑用量和時(shí)間上都要有較好的掌握[2]。消化不足組織核酸暴露不充分，陽性信號(hào)減弱或不顯示。消化過度核酸周圍組織的蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，在接下來的實(shí)驗(yàn)中核酸易丟失呈假陰性或陽性信號(hào)減弱[3]。

有文獻(xiàn)報(bào)道[4]將高壓熱修復(fù)用于石蠟包埋組織原位雜交修復(fù)。啟發(fā)我們對(duì)增強(qiáng)組織通透性環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，實(shí)驗(yàn)表明改良效果甚好。推論其原理可能是對(duì)組織進(jìn)行高溫?zé)釢B透預(yù)處理時(shí)，可以使組織細(xì)胞周圍蛋白通路打開，增加組織通透性較好促進(jìn)了探針滲透，充分與待測的靶mRNA雜交。

改良法可以對(duì)組織進(jìn)行單獨(dú)或批次的預(yù)處理。滿足特殊組織要求，標(biāo)本量多時(shí)更具優(yōu)勢，提高工作效率。Dako的EDTA修復(fù)液還具有脫蠟作用，二次脫蠟確保組織脫蠟完全，更易探針充分滲透；預(yù)處理溫度不超過100 ℃，不容易引起組織切片掉片；儀器自動(dòng)恒溫加熱不必?fù)?dān)心修復(fù)液濃度變化、干涸等不良現(xiàn)象；且溫度圖譜可視具體溫度量化值，做到實(shí)時(shí)監(jiān)測。整個(gè)預(yù)處理過程可控、快捷、穩(wěn)定，定奠了后續(xù)原位雜交質(zhì)量的保證。

目前試劑盒多采用地高辛標(biāo)記探針，雜交需4～16 h甚至過夜。改良法，滲透效果得到更好保證，使之后組織細(xì)胞中靶mRNA與探針充分接觸，雜交所需時(shí)間縮短到1 h，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程只需4～5 h?？膳cVentana全自動(dòng)免疫組化儀EBER原位雜交檢測需要時(shí)間相近，較傳統(tǒng)方法時(shí)間大大減少，亦同樣取得很好結(jié)果。

Dako全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理方法，目前本組病例數(shù)有限，實(shí)驗(yàn)也可能還存在瑕疵，但改良效果明顯。與傳統(tǒng)酶消化滲透方法檢測結(jié)果無明顯差異，陽性率基本一致；陽性信號(hào)表達(dá)更清晰可辨；特別在陽性拷貝數(shù)較低的病例更具優(yōu)勢。Dako全自動(dòng)控制的預(yù)處理滲透程序，整體流程省時(shí)、便捷，檢測結(jié)果穩(wěn)定，改良法是一種值得推薦的病理實(shí)驗(yàn)室檢測EBER的方法。