元明霞 陳曉偉 宋 波 張祥志 李宏義

1（上海理工大學(xué)光電信息與計算機工程學(xué)院太赫茲技術(shù)創(chuàng)新研究院 上海 200093）

2（北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學(xué)中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院 北京 100730）

3（中國科學(xué)院上海高等研究院上海光源 上海 201204）

維結(jié)締組織在我們體內(nèi)起著支撐、連接和分隔不同組織和器官的作用，其中的液體被稱作組織液［1］。2012年，李宏義教授團(tuán)隊在皮下注射多類示蹤劑，通過磁共振成像、熒光素照相法發(fā)現(xiàn)了下肢PLCTs的液體傳輸功能與組織中的纖維骨架有關(guān)［2］。2014年，該團(tuán)隊將順磁示蹤劑注入皮下，通過成像技術(shù)（磁共振成像、X射線、電子計算機斷層掃描（Computed Tomography，CT）、數(shù)字熒光照相機）成功研究了成像示蹤劑在纖維骨架上的行為［3］。2019年，該團(tuán)隊將熒光示蹤劑注入皮下，通過Micro-CT方法表征了存在于結(jié)締組織中定向的纖維骨架［4］。這些研究發(fā)現(xiàn)，纖維結(jié)締組織中的組織液能夠沿著纖維骨架流動［2-5］。

人體解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，皮膚組織中的兩種結(jié)構(gòu)介導(dǎo)了組織液的流動：一種真皮中的纖維組織；另一種皮下組織中縱向分布的脂肪小葉間膈。但是，皮膚組織中的三維纖維骨架結(jié)構(gòu)及有序性尚不清楚。組織學(xué)中關(guān)于皮膚組織纖維骨架的描述，大多是建立在二維的組織切片數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，并無真皮層及皮下組織中的三維纖維骨架數(shù)據(jù)。

傳統(tǒng)的X射線吸收成像無法對軟組織成清晰像，上海同步輻射光源成像線站利用同步輻射的高相干性可實現(xiàn)相襯成像，無需造影劑、示蹤劑也可對生物軟組織成清晰像［6］。我們利用上海同步輻射光源BL13W1線站的X射線相襯顯微斷層成像技術(shù)得到了皮膚的三維結(jié)構(gòu)，然后結(jié)合計算機圖形處理技術(shù)，成功表征了人真皮層中纖維骨架的三維結(jié)構(gòu)。同步輻射中的這種原位、無損、高分辨率成像技術(shù)在一定程度上很好地達(dá)到了實驗?zāi)康摹?/p>

上海同步輻射光源具有波長范圍寬、高強度、高亮度、高準(zhǔn)直性、高偏振與準(zhǔn)相干性、可準(zhǔn)確計算、高穩(wěn)定性等一系列比其他人工光源更優(yōu)異的特性，同步輻射依托其在時間、空間分辨率上的優(yōu)勢，極大地推動了生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、古生物學(xué)、植物學(xué)的研究進(jìn)展［6］。

X射線成像及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用光束線站［7］（BL13W1）光子能量范圍8～72.5 keV，線站可提供基于多種襯度機制（吸收、相位、熒光等）的無損、高分辨、動態(tài)、定量、三維的X射線成像方法。其中靜態(tài)顯微CT成像的空間分辨率達(dá)到0.32 μm/像素，有效提高了樣品三維結(jié)構(gòu)的重建質(zhì)量。上海交通大學(xué)Med-X學(xué)院徐學(xué)敏研究組利用上海光源成像線站對裸鼠Lewis肺癌血管造影成像，清晰地分辨出了腫瘤新生血管與正常血管［8］。我們表征真皮層中的纖維骨架時，空間分辨率達(dá)到了0.65 μm/像素。

1 實驗部分

1.1 樣品處理

為了實現(xiàn)高分辨率表征三維結(jié)構(gòu)的目的，我們在上海光源BL13W1線站開展了實驗，BL13W1線站的X射線相襯顯微斷層成像技術(shù)［9］對于樣品的三維大小、是否脫水處理有著嚴(yán)格的要求。

本研究的樣品取自人體標(biāo)本手部的皮膚組織（倫理號：2016BJYYEC-066-02）。處理方法：組織樣品做脫細(xì)胞處理，用1 mol·L-1NaCl溶液處理，振蕩器振蕩24 h。將樣品用正己烷浸泡、搖動24 h，然后用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗滌樣品，浸泡在1%十二烷基磺酸鈉溶液（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）中，搖動 24 h。PBS 洗滌樣品，浸泡在0.5%胰蛋白酶溶液中，搖動2.5 h。將樣品冷凍干燥24 h，并浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸銀溶液中0.5 h。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氫氧化鈉溶液與硝酸銀溶液以體積比1:1混合。0.5 h后，用去離子水輕輕洗滌樣品，再次冷凍干燥處理［4］。

1.2 實驗站包埋樣品

將巴士吸管頭部剪下，剪下部分用來放置被組織包埋液包埋的樣品。用鑷子夾住巴士吸管頭部，將其固定在冷凍切片機中，切片機溫度設(shè)定為-20℃，等待樣品冷凍成塊狀。

1.3 冷凍切片機切片

為了達(dá)到500 μm的實驗樣品要求，我們進(jìn)行了冷凍切片處理。

使用上海同步輻射光源BL08U1-B線站的Leica切片機將冷凍后的實驗樣品塊切成厚度在500 μm的切片。在切片過程中，先粗調(diào)后細(xì)調(diào)切片厚度，逼近組織塊前切換為500 μm。將處理后的切片放于清水中解凍，用銅網(wǎng)打撈飄在水面上的切片。把切片放在載玻片上自然風(fēng)干，用手術(shù)刀將切片手動切割為三個維度尺寸均在500 μm附近的待成像樣品。

1.4 BL13W1線站樣品安裝和圖像采集

將樣品放置于10 μL移液槍頭中，用膠水密封移液槍頭來固定樣品塊，防止樣品在轉(zhuǎn)動過程中發(fā)生位置偏移。然后，將內(nèi)置樣品的移液槍頭用膠帶固定于旋轉(zhuǎn)臺上，進(jìn)行X射線相襯顯微斷層成像。

實驗在上海光源BL13W1線站進(jìn)行，采用類同軸相位成像方法，如圖1所示。光子能量18 keV，能量分辨率ΔE/E=5×10-3，樣品點處光斑尺寸45 mm（H）×5mm(V)，光子通量 1× 109s-1?mm-2，體素為0.65μm，樣品與電荷耦合器件（Charge Coupled Device，CCD）之間距離為 10cm，成像視野為1331μm × 1331μm，從 180°范圍內(nèi)等步長采集 1 200幅投影，每幅投影圖像曝光時間為2s，每隔120張投影采集2張背景圖片，總共采集22張背景圖像。完成后，關(guān)閉光源采集5張暗電流圖像，整個采集過程約為3000s［9-12］。采集完成后，將樣品取下放于聚乙烯離心管中進(jìn)行保存標(biāo)記。

圖1 類同軸相位成像光路示意圖Fig.1 Schematic diagram of coaxial phase-like imaging optical path

1.5 CT三維重構(gòu)及投影圖像

一系列二維切片圖像在軟件Amira中進(jìn)行三維可視化重構(gòu)，重構(gòu)結(jié)果如圖2。

圖2 目標(biāo)樣品的三維輪廓Fig.2 3D contour of the target sample

從采集的1 200張投影圖像中抽取不同輪廓的投影圖像進(jìn)行表征，如圖3所示。

圖3 不同輪廓的投影圖像采集角度(a)0°～18°，(b)19°～36°，(c)37°～54°，(d)55°～72°，(e)73°～90°，(f)91°～108°，(g)109°～126°，(h)127°～144°，(i)145°～162°，(j)163°～180°Fig.3 Projection image acquisition angles with different contours(a)0°～18°,(b)19°～36°,(c)37°～54°,(d)55°～72°,(e)73°～90°,(f)91°～108°,(g)109°～126°,(h)127°～144°,(i)145°～162°,(j)163°～180°

2 實驗數(shù)據(jù)分析

2.1 基于BL13W1線站的圖像分析

得到的CT投影圖像需借助切片重構(gòu)軟件PITRE進(jìn)行圖像前期處理，處理流程：圖片重命名—相位恢復(fù)—斷層重構(gòu)—圖片剪切、轉(zhuǎn)換。

需要注意的是，相位恢復(fù)過程中，參數(shù)delta/beta的調(diào)整。該參數(shù)初始默認(rèn)值為1 000，采用二分法快速選定最為合適的數(shù)值10進(jìn)行相位恢復(fù)操作。一般而言，該參數(shù)越低，對比越強，邊緣增強，細(xì)節(jié)更加清楚。相位恢復(fù)算法［13］見公式：

式中：F和F-1表示傅里葉變換和傅里葉逆變換；I（x，y）和I0（x，y）表示樣品投影和背景光強；物像距離SDD為Z；δ和β表示樣品的相位和吸收信息。采用濾波反投影算法［14］對相位恢復(fù)后的投影圖像進(jìn)行斷層重構(gòu)，得到32 bit斷層圖像，后經(jīng)位數(shù)轉(zhuǎn)換得到8 bit斷層圖像。

鑒于此次研究樣品的特殊性，目標(biāo)樣品灰度值與管壁極為接近。在Amira軟件中進(jìn)行自動閾值分割時，無法做到既去除管壁又保留樣品的目的。PITRE軟件得到的8 bit圖片在清除移液槍頭管壁影像過程中存在一定的技術(shù)難度。改用圖像處理軟件ImageJ進(jìn)行圖像再加工，盡可能在不缺失目標(biāo)信息的基礎(chǔ)上去除管壁影像。

2.2 基于ImageJ、Amira軟件的圖像分析

為了獲得樣品可靠準(zhǔn)確的三維結(jié)構(gòu)信息，通過ImageJ軟件［15-17］對8 bit圖片進(jìn)行再加工。首先使用軟件的批處理功能將樣品四周的管壁清除，如圖4（b），然后將處理后的圖像棧整合。實驗所用的移液槍頭由于上下管徑不一致，增加了后期清除管壁影像過程中的繁瑣程度。

圖4 清除8 bit圖片中的管壁影像(a)清除前，(b)清除后Fig.4 Clearing the wall image of the 8-bit data picture(a)Before cleaning,(b)After clearing

為了降低后期圖像處理的難度，實驗前盡量使用上下管徑一致的透明管來放置待成像樣品。為了得到較為清晰的纖維骨架，對8 bit圖片進(jìn)行二值化處理［18］，處理流程為：導(dǎo)入圖片、創(chuàng)建副本、閾值分割、二值化處理，流程圖如圖5所示。

在完成二值化處理之后，分別進(jìn)行灰度值反轉(zhuǎn)或輪廓提取，如圖6。在Amira軟件中進(jìn)行三維重構(gòu)，得到纖維骨架在真皮層纖維結(jié)締組織中的分布。

圖5 二值化圖像的灰度化處理流程Fig.5 Grayscale processing flow of binarized image

圖6 二值化流程中，不同后處理得到的纖維骨架分布(a)灰度值反轉(zhuǎn)得到纖維骨架分布，(b)輪廓提取得到纖維骨架分布Fig.6 Fiber skeleton distribution obtained by different postprocessing during the binarization process(a)Gray value reversal to obtain fiber skeleton distribution,(b)Contour processing to obtain fiber skeleton distribution

從2 048張8 bit圖片中選取纖維分布最為密集的100 slice進(jìn)行纖維骨架表征。依據(jù)真皮層深度與纖維分布之間的關(guān)系［19］可知，該區(qū)域取自真皮中間層。

2.3 纖維骨架在真皮中間層中的分布

從得到的圖片數(shù)據(jù)，同樣可以發(fā)現(xiàn)：纖維分布與真皮層深度具有一定的關(guān)系。在真皮淺層（靠近表皮處）以及真皮深層（靠近皮下處）的纖維分布要比真皮中間層稀疏。圖7（a）、（b）取自真皮中間層同一區(qū)域，唯一區(qū)別為圖7（a）100 slice切片圖像三維正投影，圖7（b）10 slice切片圖像三維正投影。

通過分析圖7中的三維數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)：纖維絲在真皮中間層分布具有一定的趨向性。在真皮中間層中，纖維束較細(xì)，排列緊密，不互相交織，纖維絲幾乎平行于外邊緣定向延伸。這一分布特點間接地表明了組織液在纖維絲表面?zhèn)鬏數(shù)拈L程有序性、趨向性。

在共聚焦顯微鏡觀察下，無論是沿血管長軸分布的纖維絲還是皮下沿通路長軸分布的纖維絲都被熒光素染色［1］。因此，真皮中間層中縱向延伸的纖維骨架也可能是組織液傳輸?shù)耐緩健?/p>

在組織學(xué)中，結(jié)締組織的定向纖維骨架被確定為長距離皮膚通路。比較圖7（a）、（b），也容易看出纖維絲骨架在真皮中間層中的大致走向。纖維骨架延伸取向并不只是局限在平行于皮膚表面的維度，也可能以貫穿真皮中間層的形式存在。這進(jìn)一步說明了真皮層纖維結(jié)締組織中組織液傳輸通路纖維骨架結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。結(jié)構(gòu)決定功能，可見存在于纖維絲表面的生物界面流體傳輸通路在組織液長程流動過程中的重要意義。

2.4 纖維骨架在真皮淺層、深層中的分布

纖維絲除了在真皮中間層分布以外，在淺層、深層也會有少量分布［19-20］。在真皮層中，靠近表皮和靠近皮下的區(qū)域細(xì)胞間隙增大，纖維絲含量明顯減少，分布較為稀疏。在真皮深層處，纖維較粗，排列疏松，交織成網(wǎng)狀，纖維會以分枝的方式延伸生長，如圖8（b），與皮膚表面平行者居多。這個深度區(qū)域中較少的纖維成分有可能降低全層皮膚的生物力學(xué)梯度差異。

圖8 真皮淺層、深層的纖維分布(a)真皮層淺層，(b)真皮層深層Fig.8 Fiber distribution in superficial and deep dermis(a)Superficial dermis,(b)Deep dermis

實驗數(shù)據(jù)也證實了定向纖維結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)框架由多層、縱向組裝和交織的微米級纖維組成。在沿著長距離，定向且有序組裝的纖維進(jìn)行拓?fù)溥B接的界面?zhèn)鬏攨^(qū)域的網(wǎng)絡(luò)上，組織液可以在纖維結(jié)締組織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中傳輸，將之稱為“纖維組織界面?zhèn)鬏敗保?］。

對海南人臉部皮膚的相關(guān)研究表明：皮膚內(nèi)膠原纖維隨年齡增大，密度變大，纖維變粗，含量從25歲起未見減少現(xiàn)象，出現(xiàn)持平，甚至含量有所增加。在35～45歲區(qū)間，膠原纖維含量迅速減少。彈性纖維與膠原纖維相互交織分布，隨年齡增大，形態(tài)斷裂、增粗，片段化，局部成塊狀分布［21］。這充分揭示，纖維絲表面的組織液傳輸在人類皮膚研究中有可能存在的生物學(xué)意義。

2.5 真皮層中纖維骨架的三維表征

從PITRE中得到的8 bit圖片在ImageJ中進(jìn)行再處理后，導(dǎo)入Amira中進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)表征。表征結(jié)構(gòu)如圖9所示。

通過對比圖9（a）、（b），很容易發(fā)現(xiàn)：真皮中間層纖維分布較為密集，真皮深層纖維分布較為稀疏。8 bit圖片在Amira中的三維結(jié)構(gòu)可視化表征進(jìn)一步佐證了纖維絲在真皮層不同深度的分布特點。

圖9 真皮中間層、深層的三維可視化表征(a)真皮中間層，(b)真皮深層Fig.9 Three-dimensional visualization of the middle and deep layers of the dermis(a)Middle layer of the dermis,(b)Deep layer of the dermis

3 結(jié)語

纖維結(jié)締組織中的纖維骨架結(jié)構(gòu)研究，一直缺少三維結(jié)構(gòu)信息。目前，我們通過上海光源X射線相襯顯微斷層成像技術(shù)獲得原始CT投影數(shù)據(jù)，經(jīng)過一系列圖像處理軟件ImageJ、Amira重構(gòu)得到真皮層纖維骨架高分辨率的三維結(jié)構(gòu)信息，為理解存在于纖維軌道中的組織液流動給出了高分辨的研究方法。本次實驗中用到的是靜態(tài)顯微CT成像技術(shù)，在分辨率層面較先前的成像技術(shù)有了很大的提高，分辨率達(dá)到了0.65 μm/像素?；贐L13W1線站上動態(tài)顯微CT成像技術(shù)的成熟，我們未來可以結(jié)合原位冷凍成像技術(shù)來研究熒光示蹤之后的組織液在纖維骨架表面動態(tài)傳輸?shù)臋C制。

合肥同步輻射光源已經(jīng)實現(xiàn)了以軟X射線研究活體生物樣品的二維或三維高分辨顯微成像的目的。軟X射線波段存在2.34（氧的K吸收邊）～4.38 nm（碳的K吸收邊）范圍的“水窗”，對此范圍能量的X射線，水的吸收很弱，而有機分子的吸收強烈，特別適合于有水的活體生物樣品。對于進(jìn)一步研究組織液在纖維絲表面的研究可起到技術(shù)支持，成功解決了上海光源脫水處理法對研究目的的局限性［22］。

三維纖維骨架的高分辨率可視化表征將有助于推動組織液長程流動的研究，將為生物醫(yī)學(xué)與圖像處理之間建立更為密切的聯(lián)系。

致謝 感謝上海光源提供的技術(shù)支持與幫助，感謝北京醫(yī)院提供的試驗樣品。