黃 艷，黃科文，廖明安，林立金，王 進(jìn)，呂秀蘭*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130）

近年來，重金屬污染土壤的問題對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的威脅越來越大，其污染面積和程度呈上升趨勢(shì)，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和人民健康帶來了嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)和危害［1］。鎘是我國農(nóng)田土壤污染較為嚴(yán)重且普遍的主要重金屬元素，因其不能在生物體內(nèi)降解而成為一種極具毒性的重金屬元素［2］。葡萄是世界上重要的栽培果樹之一，也是最古老、最早栽培的果樹之一，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受人們喜愛。土壤中鎘含量過多將會(huì)影響葡萄的生長(zhǎng)，已有研究表明，我國部分地區(qū)葡萄園土壤中的鎘含量已超過綠色食品產(chǎn)地土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或鎘污染已達(dá)到輕度污染等級(jí)，對(duì)葡萄果品安全造成嚴(yán)重危害［3-5］。因此，研究葡萄園土壤的鎘污染修復(fù)，保證葡萄果品的安全、綠色和可持續(xù)生產(chǎn)十分重要。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，間作套種或混作可通過根系和地上結(jié)構(gòu)的互利互補(bǔ)促進(jìn)作物對(duì)養(yǎng)分、水、光等資源的利用，使產(chǎn)量增加［6］。前人研究表明［7-8］，白三葉混種德國鳶尾能夠用于鉛污染土壤的修復(fù)，白車軸草混種紫花地丁能較好修復(fù)鎘污染。在土壤鎘污染條件下，鬼針草屬植物與葡萄幼苗混種可降低葡萄幼苗的鎘含量［9］。

嫁接繁殖是廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)上的果樹、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物的繁育方法。有研究結(jié)果表明，嫁接導(dǎo)致的生物脅迫可以通過誘導(dǎo)植物的生理變異來提高植物的抗性［10］，嫁接還可以引起植物 DNA 甲基化，并將這種變異遺傳給后代［11］。自根苗嫁接可促進(jìn)硫華菊及鳳仙花后代的生長(zhǎng)［12］。在鎘污染條件下，嫁接可以提高少花龍葵和薺菜后代的生物量［13-14］，提高鎘超富集植物少花龍葵地上部鎘積累量和鎘富集植物薺菜后代植株的鎘積累量［15］，說明嫁接可以提高鎘超富集或鎘富集植物后代的重金屬積累能力。鳳仙花是一種鎘富集型花卉植物，對(duì)鎘污染土壤的修復(fù)能力較弱［16］。研究表明，采用自根苗嫁接能夠促進(jìn)鎘污染條件下鳳仙花后代的生長(zhǎng)，提高其對(duì)鎘的吸收與積累，從而提高了其對(duì)鎘污染土壤的修復(fù)能力［17］。因鳳仙花嫁接后代對(duì)鎘的吸收有明顯的促進(jìn)作用，因此，本研究通過將鳳仙花進(jìn)行未嫁接、同株嫁接、異株同苗嫁接、異株異苗嫁接處理，用不同處理的鳳仙花嫁接后代與葡萄幼苗進(jìn)行混種，旨在探究鳳仙花嫁接后代與葡萄混種對(duì)葡萄幼苗生長(zhǎng)和鎘積累的影響，以期篩選出能顯著降低葡萄幼苗鎘含量的鳳仙花嫁接后代，為葡萄園鎘污染修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與土壤

供試鳳仙花種子采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)（東經(jīng) 103°50′，北緯 30°42′）周圍農(nóng)田；供試葡萄為‘夏黑’的扦插苗，來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州基地。供試土壤取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)周邊農(nóng)田，其基本理化特性為：pH 值7.06，全氮1.48 g/kg，全磷0.78 g/kg，全鉀17.82 g/kg，堿解氮 94.65 mg/kg，有效磷 6.28 mg/kg，速效鉀 149.52 mg/kg，其中供試土壤背景有效鎘含量未檢出。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鳳仙花嫁接處理

2017 年4月將取自同一株鳳仙花的種子進(jìn)行播種和育苗，待植株長(zhǎng)到一定高度時(shí)進(jìn)行嫁接處理［17］。嫁接處理方式如下：1）不嫁接處理（CK）。鳳仙花幼苗移栽種植，收集種子保存。2）同株嫁接（SG）。選用一株約10 cm 高的鳳仙花，以苗上部（約 4 cm）作接穗，苗下部莖段（約6 cm）作砧木進(jìn)行嫁接，并保留砧木葉片。3）異株同苗嫁接（UG）。選用2株株高約10 cm 的鳳仙花，將一株取苗上部（約 4 cm）作接穗，另一株苗下部莖段（約6 cm）作砧木進(jìn)行嫁接，并保留砧木葉片。4）異 株 異 苗 嫁 接（DG）。選用 2 株株高分別約5和 10 cm 的鳳仙花，將株高 10 cm 的鳳仙花下部莖段（約 6 cm）作砧木，株高 5 cm 的鳳仙花取上部苗（約 4 cm）作接穗進(jìn)行嫁接。

均采用劈接法嫁接。用寬約 1 cm、長(zhǎng) 20 cm 的塑料帶進(jìn)行綁縛，使砧木與接穗的結(jié)合部分牢牢地貼在一起，并種植在營(yíng)養(yǎng)土中。嫁接成活后，將鳳仙花全部移植到無重金屬污染的濕潤(rùn)土壤中。待鳳仙花開花時(shí)，采用硫酸紙袋進(jìn)行套袋隔離。種子成熟后，分別收集種子保存待用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年2月，將風(fēng)干后的供試土壤過5 mm篩，用15 cm×18 cm（直徑×高）塑料盆每盆裝入3.0 kg，以CdCl2·2.5H2O 分析純形式加入重金屬鎘并混勻，使土壤鎘濃度為5 mg/kg。保持土壤濕潤(rùn)，保持土壤田間持水量的80%，自然放置平衡4 周，不定期翻土混合，保證土壤充分混合均勻。2018 年 4月，將不同嫁接處理的鳳仙花后代種子進(jìn)行分別育苗。2018 年5月挑選生長(zhǎng)基本一致的‘夏黑’葡萄當(dāng)年扦插幼苗（新梢長(zhǎng)約 10 cm）及鳳仙花嫁接后代（2 對(duì)真葉展開）栽入塑料盆中，葡萄單種每盆 3 株，葡萄與鳳仙花嫁接后代混種為每盆葡萄 2 株，鳳仙花嫁接后代 2 株，每個(gè)處理重復(fù)3 次。盆與盆之間的距離為 15 cm，完全隨機(jī)擺放。保證其在自然狀況下生長(zhǎng)，根據(jù)盆中土壤缺水情況，不定期澆水（水中未檢出鎘），使土壤保持濕潤(rùn)。為防止污染物淋溶滲漏損失，在盆下放置塑料托盤并將滲漏液倒回盆中。在整個(gè)生長(zhǎng)過程中不定期的交換盆與盆的位置以減弱邊際效應(yīng)的影響，并及時(shí)去除雜草，防治病蟲害。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

2018 年 6 月，采集葡萄幼苗其從上往下的第 3或第4片功能葉，測(cè)定葉片的光合色素（葉綠素 a、葉綠素b 和類胡蘿卜素）含量及抗氧化酶（SOD、CAT）活性。光合色素含量采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定［18］，SOD 活性采用氮藍(lán)四唑法進(jìn)行測(cè)定［18］，CAT活性采用高錳酸鉀滴定法進(jìn)行測(cè)定［18］。之后將葡萄和鳳仙花嫁接后代整株收獲，土壤分開存放。將葡萄植株分成根、莖、葉 3 部分，將鳳仙花嫁接后代植株分為根系和地上部?jī)刹糠?，分別用自來水洗凈，再用去離子水沖洗 3 次后，于110 ℃殺青 15 min，80 ℃烘干至恒重，稱重，然后粉碎，過0.149 mm篩，植物樣品由硝酸和高氯酸（體積比為4∶1）消化后用 iCAP 6300 型 ICP 光譜儀（Thermo Scientific，USA）測(cè)定鎘含量［19］。土壤自然風(fēng)干后過 1 mm篩，土壤 pH 值采用土水比 1∶2.5進(jìn)行測(cè)定。土壤有效態(tài)鎘含量由 DTPA-TEA 提取并 ICP-MS 分析測(cè)定［20］。 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù) = 地上部鎘含量 /根系鎘含量［21］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗生物量的影響

由表1可知，混種異株異苗株鳳仙花嫁接后代與混種鳳仙花未嫁接后代和葡萄單種相比，均顯著提高了葡萄幼苗根系和地上部分的生物量。葡萄幼苗根系的生物量按照由大到小的順序排列依次為單種＜混種鳳仙花同株嫁接后代＜混種鳳仙花異株同苗株嫁接后代＜混種鳳仙花未嫁接后代＜混種鳳仙花同株嫁接后代＜混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代。葡萄幼苗地上部分的生物量按照由大到小的順序排列依次為混種鳳仙花未嫁接后代＜單種＜混種鳳仙花同株嫁接后代＜混種鳳仙花異株同苗株嫁接后代＜混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代。與葡萄單種相比，混種異株異苗株鳳仙花嫁接后代葡萄幼苗根系和地上部分的生物量分別增加了47.25%和23.16%。另外，混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代葡萄幼苗的根冠比也最高。

表1 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗生物量的影響

2.2 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗光合色素的影響

由表2可知，在鎘脅迫條件下，混種鳳仙花嫁接后代與葡萄單種相比，不同程度地增加了葡萄幼苗的光合色素。混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代的葡萄幼苗葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量均顯著高于葡萄單種。與鳳仙花嫁接后代混種的葡萄幼苗葉片葉綠素總量由大到小的順序排列依次為單種＜混種鳳仙花未嫁接后代＜混種鳳仙花異株同苗株嫁接后代＜混種鳳仙花同株嫁接后代＜混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代；類胡蘿卜素含量由大到小的順序排列依次為單種＜混種鳳仙花未嫁接后代＜混種鳳仙花同株嫁接后代＜混種鳳仙花異株同苗株嫁接后代＜混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代?；旆N異株異苗株鳳仙花嫁接后代葡萄幼苗的葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量與葡萄單種相比分別增加了20.48%、26.68%和14.12%。

表2 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗光合色素的影響 （mg/g）

2.3 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗抗氧化酶活性、可溶性糖和可溶性蛋白的影響

在土壤鎘脅迫條件下，混種鳳仙花嫁接后代可顯著提高葡萄幼苗抗氧化酶（SOD、CAT）活性。由表3可知，混種鳳仙花嫁接后代葡萄幼苗的SOD 和CAT活性均顯著高于葡萄單種。葡萄幼苗的SOD 和CAT活性表現(xiàn)為單種＜混種鳳仙花未嫁接后代＜混種鳳仙花同株嫁接后代＜混種鳳仙花異株同苗株嫁接后代＜混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代。葡萄幼苗的SOD 活性較葡萄單種分別提高了11.31%、17.51%、28.15%和32.35%；CAT活性較葡萄單種分別提高了10.05%、25.98%、26.85%和38.16%。

混種鳳仙花嫁接后代葡萄幼苗可溶性糖含量與葡萄單種相比均顯著增加，其中混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代葡萄幼苗的可溶性糖含量最高，較葡萄單種增加了44.14%。混種鳳仙花同株嫁接后代和混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代葡萄幼苗可溶性蛋白含量與葡萄單種相比均顯著增加，較葡萄單種分別增加了29.90%和31.48%。

表3 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗抗氧化酶活性、可溶性糖和可溶性蛋白的影響

2.4 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗鎘含量的影響

由表4可知，與鳳仙花嫁接后代混種的葡萄幼苗根系和地上部分的鎘含量均顯著低于葡萄單種。葡萄幼苗的根系和地上部分的鎘含量均表現(xiàn)為單種＞混種鳳仙花未嫁接后代＞混種鳳仙花同株嫁接后代＞混種鳳仙花異株同苗株嫁接后代＞混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代。按鎘含量由高到低，混種鳳仙花嫁接后代葡萄幼苗根系的鎘含量與葡萄單種相比分別降低了15.18%、17.13%、56.67%和83.53%?；旆N鳳仙花異株異苗株嫁接后代的葡萄幼苗地上部分的鎘含量最低。就轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)而言，混種鳳仙花嫁接后代均降低了葡萄幼苗的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，其中混種鳳仙花異株異苗株嫁接后代葡萄幼苗的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最低。

表4 混種鳳仙花嫁接后代對(duì)葡萄幼苗鎘含量的影響

2.5 與葡萄混種的鳳仙花嫁接后代生物量及鎘積累

由表5可知，在土壤鎘脅迫條件下，混種葡萄幼苗會(huì)不同程度地影響鳳仙花嫁接后代的生物量、鎘含量和鎘積累量。與葡萄混種的鳳仙花嫁接后代根系和地上部分的生物量均顯著大于未嫁接后代，同株嫁接后代和異株同苗株嫁接后代根系和地上部分的鎘含量顯著低于未嫁接后代。就鎘積累量而言，與葡萄混種的鳳仙花嫁接后代根系和地上部分的鎘積累量均顯著大于未嫁接后代，其中異株異苗株嫁接后代根系和地上部分的鎘積累量達(dá)到最大值，分別為30.31和171.10 μg，較未嫁接后代分別增加46.45%和44.06%。

2.6 混種后土壤 pH 值及有效態(tài)鎘含量

由圖1可知，在鎘脅迫條件下，葡萄幼苗混種鳳仙花嫁接后代土壤中的pH 值較葡萄單種顯著增加，具體表現(xiàn)為單種＜未嫁接后代＜同株嫁接后代＜異株同苗株嫁接后代＜異株異苗株嫁接后代。由圖2可知，葡萄幼苗混種鳳仙花嫁接后代土壤中的有效態(tài)鎘含量較葡萄單種顯著降低，具體表現(xiàn)為單種＞未嫁接后代＞同株嫁接后代＞異株同苗株嫁接后代＞異株異苗株嫁接后代。

圖1 混種對(duì)土壤 pH 值的影響

圖2 混種對(duì)土壤有效態(tài)鎘含量的影響

3 討論

植物間混種可通過根際對(duì)話影響植物的生長(zhǎng)，在重金屬污染條件下，植物分泌的低分子量有機(jī)酸通過形成可溶性絡(luò)合物而增加重金屬元素在根際土壤的移動(dòng)性［22］。另外根系分泌物可改變重金屬的生物有效性和毒性，并在植物吸收重金屬的過程中發(fā)揮重要作用［23］?；旆N還可以通過增強(qiáng)植物與植物、植物與環(huán)境間的相互作用來提高植物對(duì)外界脅迫的抗逆性，從而提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)與產(chǎn)量［24-25］。孫國超等［26］研究發(fā)現(xiàn)樹番茄幼苗混種繁縷可有效降低鎘污染土壤上樹番茄幼苗的鎘積累，同時(shí)達(dá)到修復(fù)鎘污染土壤的效果。練華山等［27］研究表明混種牛膝菊嫁接后代能夠促進(jìn)樹番茄幼苗的生長(zhǎng)，并降低樹番茄的鎘含量。本研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，研究發(fā)現(xiàn)鳳仙花嫁接后代和葡萄幼苗混種能夠提高葡萄幼苗生物量，顯著降低葡萄幼苗根及地上部分的鎘含量。

光合作用是植物最重要的生理反應(yīng)之一，其光合色素含量水平高低直接反映了光合能力的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在土壤鎘脅迫條件下，混種鳳仙花嫁接后代與葡萄單種相比，不同程度地增加了葡萄幼苗的光合色素?；旆N鳳仙花異株異苗株嫁接后代的葡萄幼苗葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量均顯著高于葡萄單種，這和前人研究結(jié)果一致［28］。

Michael等［29］認(rèn)為植物細(xì)胞中可溶性蛋白可與重金屬離子結(jié)合形成金屬結(jié)合蛋白，從而降低植物細(xì)胞中游離態(tài)重金屬離子的含量，以減輕重金屬離子對(duì)植物細(xì)胞的傷害；糖是參與調(diào)節(jié)滲透脅迫的小分子物質(zhì)，在植物對(duì)重金屬的適應(yīng)性調(diào)節(jié)中，是增加滲透性溶質(zhì)的重要組成部分。韓淑梅等［30］研究表明在土壤鎘脅迫條件下，植物通過一系列生理生化反應(yīng)形成了一定耐性機(jī)制，通過增加脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白為鎘耐性相關(guān)蛋白的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，增強(qiáng)了植物耐受重金屬的能力。植物還可通過提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，及時(shí)清除過量的活性氧自由基，減緩鎘脅迫的毒害作用［31］。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，葡萄幼苗混種鳳仙花嫁接后代提高了抗氧化酶活性、可溶性蛋白及可溶性糖含量，這與前人的研究結(jié)果一致［9］。

研究表明，重金屬脅迫會(huì)促進(jìn)植物根系分泌物的釋放，可通過改變根際pH值等理化性質(zhì)間接地影響重金屬在土壤中的有效性［32］，土壤pH值是決定重金屬形態(tài)及分布的直接因素［33］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鳳仙花嫁接后代和葡萄幼苗混種顯著增加了土壤pH值，并降低了土壤的有效態(tài)鎘含量。這可能是鳳仙花嫁接后代和葡萄幼苗混種產(chǎn)生了根際對(duì)話，改變了根際土壤環(huán)境，提高了土壤養(yǎng)分有效性，從而促進(jìn)了鳳仙花嫁接后代對(duì)重金屬鎘的吸收。

4 結(jié)論

在鎘脅迫條件下，葡萄幼苗混種鳳仙花嫁接后代可提高葡萄幼苗生物量、光合色素含量、抗氧化酶活性、可溶性蛋白及可溶性糖含量，并顯著降低葡萄幼苗根及地上部分的鎘含量，增加土壤pH值，降低土壤的有效態(tài)鎘含量。其中，葡萄幼苗與鳳仙花異株異苗株嫁接后代混種效果最佳，使葡萄幼苗的生物量及鳳仙花嫁接后代的鎘積累量均達(dá)到最大值，且葡萄幼苗地上部分的鎘含量顯著低于其他處理。因此，本研究的鳳仙花嫁接后代均可應(yīng)用于葡萄園鎘污染土壤的修復(fù)，且最佳材料是鳳仙花異株異苗株嫁接后代。