俞 操，王宇皓，姚心怡，沈祥峰

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥，神經(jīng)病變可累及植物神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、感覺神經(jīng)，產(chǎn)生疼痛麻木、神經(jīng)功能障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙。臨床上前期出現(xiàn)肢端感覺異常，有時(shí)伴痛覺過敏。隨后有肢痛,呈隱痛、刺痛或燒灼樣痛,后期可見運(yùn)動(dòng)神經(jīng)受累,出現(xiàn)肌張力減弱、肌力減弱乃至肌萎縮和癱瘓。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)尚未有DPN病名的載錄，紀(jì)文倩結(jié)合古代典籍與DPN患者疾病過程中表現(xiàn)的臨床特點(diǎn)，將本病歸納為“消渴痹證”，即“消渴”伴有“麻木”、“痹癥”、“痿證”等[1]，故防治DPN多從化瘀入手。

血脂代謝與DPN發(fā)生機(jī)制的相關(guān)性尚存在爭議；氧化應(yīng)激作為DPN的潛在機(jī)制已受廣泛關(guān)注，而MDA、SOD則是評(píng)估機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。既往研究已經(jīng)證實(shí)運(yùn)脾和絡(luò)顆粒具有活血化瘀、運(yùn)脾除濕之效，能夠起到改善DPN大鼠神經(jīng)功能、血流動(dòng)力狀況的作用[2]，故本研究從大鼠脂質(zhì)代謝與氧化應(yīng)激的角度出發(fā)，通過觀察運(yùn)脾和絡(luò)顆粒對(duì)大鼠血脂和血清SOD、MDA含量的影響，研究并探討運(yùn)脾和絡(luò)顆粒防治DPN的作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔型健康雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量(200±15)g,于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入,許可證號(hào):SYXK(浙)2014-0001 ,由浙江省中藥研究所的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)及管理。

1.2 藥物與試劑

運(yùn)脾和絡(luò)顆粒（當(dāng)歸15 g、黃芪30 g、蒼術(shù)20 g、赤芍20 g、金銀花15 g、蒼術(shù)20 g、漢防己15 g、玄參12 g、威靈仙12 g）由浙江省中藥研究所制劑室提供；甲鈷胺：衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20143107。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；葡萄糖（GLU）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDLC）、高密度脂蛋白（HDLC）試劑盒，由寧波市慈城生化試劑廠生產(chǎn)。

1.3 造模與給藥

給80只清潔型健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組（正常組），剩余70只為造模組。給禁食12 h的大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/Kg并于3天后測量血糖，挑選血糖＞16.7 mmol/L的大鼠50只。剔除不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，隨機(jī)分成5組，保證各組大鼠體重與血糖均衡。其中模型組10只，甲鈷胺組10只，運(yùn)脾和絡(luò)顆粒高、中、低劑量組各10只。

1.4 指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)完成后，在大鼠尾靜脈取血，葡萄糖氧化酶法測血糖。實(shí)驗(yàn)中分二次對(duì)大鼠血清膽固醇和甘油三酯進(jìn)行測定，分別于給藥12周和給藥24周時(shí)，從大鼠眼眶取血，分離血清，TC與TG測定采用酶法。第24周時(shí)測定LDLC，HDLC。于第12周檢測SOD、MDA的含量，SOD測定：采用黃嘌呤氧化酶法。MDA測定：采用硫代巴比妥酸法。于第19周測量大鼠尾神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s描述,統(tǒng)計(jì)學(xué)資料使用SPSS 19.0版本軟件數(shù)據(jù)包處理。組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般狀況

在實(shí)驗(yàn)中，正常組大鼠表現(xiàn)機(jī)警，反應(yīng)正常，活動(dòng)正常，皮毛整齊而富光澤，舌淡紅，體重正常并呈上升趨勢(shì)；其余組大鼠則表現(xiàn)均為飲食、尿量增多，并有一定程度的消瘦，而模型組表現(xiàn)最明顯：在第二周開始精神不振，眼瞇無神，嗜睡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，毛發(fā)脫落多，色澤暗淡。實(shí)驗(yàn)后期，模型組大鼠舌絳紫紅暗，尾部出現(xiàn)皮下瘀紫。運(yùn)脾和絡(luò)高、中劑量組的大鼠上述癥狀得到明顯改善，低劑量組有所改善但不明顯。陽性對(duì)照組甲鈷胺組在反應(yīng)程度、活動(dòng)度、毛色方面有明顯改善，而舌下絳紫、皮下瘀紫方面無明顯改善。

2.2 各組大鼠血糖狀況

與正常組相比，模型組給藥前后血糖均增高（P＜0.001）；與模型組相比，其余各組血糖都有降低，而運(yùn)脾和絡(luò)顆粒高劑量組血糖降低是最為明顯的（P＜0.01），而中、低劑量組相對(duì)次之（P＜0.01，P＜0.05）；運(yùn)脾和絡(luò)顆粒各劑量組呈現(xiàn)出一定劑量相關(guān)性。陽性對(duì)照組甲鈷胺組血糖有所降低，但不如運(yùn)脾和絡(luò)顆粒各劑量組降糖作用明顯。給藥24周時(shí)，運(yùn)脾和絡(luò)顆粒各劑量組與給藥12周時(shí)相比血糖略有提高。見表1。

表1 運(yùn)脾和絡(luò)顆粒對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響

2.3 DPN大鼠尾神經(jīng)傳導(dǎo)速度情況與運(yùn)脾和絡(luò)顆粒的影響

與正常組比較，模型組神經(jīng)傳導(dǎo)速度慢(P＜0.001)，說明DPN大鼠造模成功，伴隨病程延長，神經(jīng)傳導(dǎo)速度逐漸降低。通過運(yùn)脾和絡(luò)顆粒各劑量組治療后，神經(jīng)傳導(dǎo)速度快于對(duì)照組(P＜0.05)。這意味著運(yùn)脾和絡(luò)顆粒在預(yù)防和改善DPN上有一定效果。見表2。

表2 運(yùn)脾和絡(luò)顆粒對(duì)DPN大鼠尾神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

2.4 DPN大鼠的血脂情況與運(yùn)脾和絡(luò)顆粒的影響

與模型組比較，運(yùn)脾和絡(luò)顆粒組能明顯降低DPN大鼠的高膽固醇，降低DPN大鼠較高的血清低密度脂蛋白，升高DPN大鼠較低的血清高密度脂蛋白，作用呈劑量相關(guān)性。見表3、表4。

表3 運(yùn)脾和絡(luò)顆粒對(duì)DPN大鼠血清膽固醇的影響（n=10）

表4 運(yùn)脾和絡(luò)顆粒對(duì)DPN大鼠血清高、低密度脂蛋白的影響（n=10）

2.5 DPN大鼠的SOD、MOD情況與運(yùn)脾和絡(luò)顆粒的影響

與模型組比較，運(yùn)脾和絡(luò)顆粒組大鼠血清中MDA含量顯著降低、SOD含量顯著升高，其中以運(yùn)脾和絡(luò)顆粒高劑量組最明顯（P＜0.01），說明運(yùn)脾和絡(luò)顆粒能增強(qiáng)抗氧化能力，提高機(jī)體免疫力。見表5。

表5 運(yùn)顆和絡(luò)粒對(duì)DPN大鼠血清SOD、MDA含量的影響（±s）

表5 運(yùn)顆和絡(luò)粒對(duì)DPN大鼠血清SOD、MDA含量的影響（±s）

注：與模型比：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

組別 劑量（g/kg）SOD（NU/ml）MDA（nmol/ml）正常 316.59±64.70*** 9.46±1.55***模型 203.28±62.02 15.34±2.54運(yùn)絡(luò)高 10 279.38±34.96** 10.87±2.13**運(yùn)絡(luò)中 5 252.28±32.40* 12.03±1.95**運(yùn)絡(luò)低 2.5 240.24±26.03 13.38±1.41甲鈷胺 2.5 257.81±34.00* 12.83±1.56*

3 討 論

運(yùn)脾和絡(luò)各劑量組均降低DPN大鼠血糖，但于24周時(shí)血糖較12周有所提高。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，以清熱、養(yǎng)陰、生津的中藥為主的大鼠降糖試驗(yàn)中[3]，大鼠血糖隨給藥時(shí)間增長而不斷降低，也可能提示運(yùn)脾和絡(luò)顆粒以健運(yùn)脾胃功能為主、活血和絡(luò)為輔，能夠降低大鼠血糖并穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。

目前DPN病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清晰，有血糖代謝紊亂、脂代謝異常、微血管病變及血流障礙氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)營養(yǎng)缺乏、免疫損傷等因素[4]。血脂代謝與DPN發(fā)生相關(guān)機(jī)制尚未明確。早期Knuiman研究發(fā)現(xiàn)，血脂紊亂與糖尿病腎臟損害和血管病變成正相關(guān)，而與DPN病變無明顯相關(guān)性[5]；但Mohapatra等研究顯示血脂異常能夠增加DPN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6]，Perez-Matos等文獻(xiàn)研究顯示，多種降脂療法對(duì)DPN改善有積極影響，如他汀類藥物降脂治療、貝特類藥物降脂治療等[7]。國內(nèi)亦有研究顯示，運(yùn)用活血化瘀補(bǔ)氣等中藥在降低血脂的情況下能夠改善DPN[8-9]。綜上，盡管脂質(zhì)代謝異常與DPN的相關(guān)性尚未得出統(tǒng)一研究結(jié)果，仍應(yīng)該將脂質(zhì)代謝正?；鳛轭A(yù)防或治療DPN的一個(gè)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)運(yùn)脾和絡(luò)顆粒高劑量組治療后大鼠血脂降低，DPN得到改善，這與前述一些學(xué)者的研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激損傷作為糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在機(jī)制之一也廣受關(guān)注。氧化應(yīng)激是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡的過程，指機(jī)體受到刺激后，產(chǎn)生大量活性分子從而導(dǎo)致組織損傷。MDA（丙二醇）是多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，參與脂質(zhì)氧化，為評(píng)估DM2患者氧化應(yīng)激最常用的生物標(biāo)志之一[10]。SOD（超氧化物歧化酶）則是生物體內(nèi)抗氧化酶系中主要成員之一，是紅細(xì)胞內(nèi)的一種胞漿低分子金屬蛋白，能夠通過還原成氧分子和過氧化氫的方式降低氧自由基，使細(xì)胞損傷減少[11]。機(jī)體清除自由基的能力及脂質(zhì)過氧化程度可通過測定兩者水平反映。Vincent等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SOD2（錳超氧化物歧化酶）活性增高降低了DRG（背根神經(jīng)節(jié)）神經(jīng)元中的超氧陰離子，繼而阻斷Caspase-3的活化和細(xì)胞損傷，是神經(jīng)元抗氧化、防御高血糖損傷的重要細(xì)胞調(diào)節(jié)因子[12]。劉春倩使用中藥九蟲丹治療DPN大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)T-SOD水平增高，MAD水平降低[13]；秦保峰等用補(bǔ)氣活血中藥治療DPN患者發(fā)現(xiàn)SOD水平治療后顯著升高，MDA水平則顯著低于正常組[14]，這與本研究結(jié)果一致。

中醫(yī)認(rèn)為，脾虛致消是糖尿病病機(jī)重要機(jī)理之一[15]。久食肥甘，濕熱、痰濁內(nèi)生，脾氣不行，久則瘀滯入血，發(fā)為痰瘀、血瘀。故而，治應(yīng)以祛邪化痰、運(yùn)脾和絡(luò)、活血化瘀為主，兼以扶正治本。運(yùn)脾和絡(luò)顆粒是由張仲景所著《傷寒雜病論》中的防己黃芪湯化裁而來，由蒼術(shù)、黃芪、防己、當(dāng)歸、玄參、威靈仙、赤芍、金銀花組成，具有益氣活血、運(yùn)脾和絡(luò)、祛邪化痰的療效。黃芪性味甘溫為君，張?jiān)豙16]言其“善治脾胃虛弱，瘡瘍血脈不行，”起補(bǔ)氣升陽、益氣固表、利水除濕之效，配合防己祛風(fēng)行水，使風(fēng)濕得去，表虛得固；易白術(shù)為蒼術(shù)，張隱齋[17]指出“凡欲補(bǔ)脾，則用白術(shù)；凡欲運(yùn)脾，則用蒼術(shù)”，改用蒼術(shù)運(yùn)脾之力尤甚；金銀花、玄參、赤芍、當(dāng)歸涼血活血和血，威靈仙勝濕通絡(luò)除痹，共奏活血化瘀之效。故全方起到活血化瘀通絡(luò)、運(yùn)脾除濕益氣之功。

此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DPN模型組的血脂代謝狀況較正常組更差，評(píng)定氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)SOD含量低于正常組，MDA含量高于正常組。而運(yùn)脾和絡(luò)顆粒能改善DPN模型血脂代謝異常狀態(tài)，顯著增高SOD含量和降低MDA含量，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，這可能是其改善DPN的作用機(jī)制之一。而不足之處是，本研究尚缺少對(duì)血脂代謝、氧化應(yīng)激與DPN發(fā)生具體機(jī)制的探討，以待學(xué)者作進(jìn)一步的研究。