劉志鵬，楊李勝*，黃敏興，柯華南

1. 廣東省生物工程研究所/廣州甘蔗糖業(yè)研究所（廣州 510000）；2. 中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心（廣州 510000）

咪鮮胺又名施保克，其通用名為Prochloraz，化學(xué)名為N-丙基N-[2-（2, 4, 6-三氯苯氧基）乙基]-1咪唑基甲酰胺（LPAC），在動植物體內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物為2, 4, 6-trichbrophenbor（2, 4, 6-TCP）[1]。咪鮮胺及其制劑進(jìn)入我國市場后，推廣應(yīng)用發(fā)展很快，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)林產(chǎn)品的生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸?shù)冗^程中[2]。咪鮮胺是一種咪唑類廣譜殺菌劑，可用于谷類、熱帶和亞熱帶水果、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物的病蟲害的防治[3]。盡管咪鮮胺是低毒殺菌劑，但其最終產(chǎn)物2,4, 6-三氯苯酚是環(huán)境中的重要污染物之一，會污染生態(tài)環(huán)境，并會對人類健康造成潛在威脅。因此，其在水果生產(chǎn)和儲藏中的殘留問題越來越受到人們關(guān)注[4]。咪鮮胺最大殘留限量被美國和歐盟嚴(yán)格監(jiān)測，在水果中的最大殘留限量（MRL）一直在很低的水平上[5]。

目前，國內(nèi)外已發(fā)表的對咪鮮胺殘留物的檢測主要采用色譜法[6]，主要是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[7]、高效液相色譜-質(zhì)譜、高效液相色譜和氣相色譜。尹桂豪等[8]采用氣相色譜法對芒果中咪鮮胺殘留分析；韓麗君等[9]采用GC-ECD研究了咪鮮胺及其代謝物在水稻中的總殘留量檢測方法；De-Paoli等[10]對咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物殘留在蔬菜、水果和小麥樣品組合簡化測定氣相色譜法。

但這些方法卻存在著一些問題：一是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-質(zhì)譜的前處理方法雖然簡單，但儀器昂貴且難以普及應(yīng)用；二是使用高效液相色譜只可以檢測咪鮮胺的殘留量，但不能檢測其全部的代謝物，尤其是2, 4, 6-三氯苯酚的殘留量，且靈敏度比氣相色譜低[4]；三是樣品前處理方法技術(shù)落后，在處理大量樣品時需要消耗大量的試劑、玻璃儀器和時間，效率較低。

此次試驗同樣采用氣相色譜法對水果中的咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物殘留檢測方法進(jìn)行研究，對樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，縮短提取過程的時間也能最大限度地提取咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物；減少多余的玻璃儀器使用；并且采用一種新的方法進(jìn)行凈化，避免了使用濃硫酸帶來的安全性隱患以及在操作過程中調(diào)節(jié)pH帶來的不確定性，提高了方法的選擇性和靈敏度，從而建立一套快速、便捷、安全、清潔、耗時短、低成本且靈敏度高的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試樣蘋果、葡萄、西瓜、柑橘等水果，市售。

咪鮮胺、2, 4, 6-三氯苯酚（純度均不少于99.0%），德國DR公司；吡啶鹽酸鹽、鹽酸、濃硫酸、無水硫酸鈉（使用前在55 ℃下烘干2 h，冷卻后使用），均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；二氯甲烷、丙酮、石油醚、乙腈、正己烷，均為色譜級，美國默克公司；試驗用水均為一級水。

7890B氣相色譜儀，美國安捷倫公司；TLE204E電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-2可調(diào)式電砂浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；RV 8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（德國IKA）；SYG-1230水浴箱，上海珂淮儀器有限公司；T25均質(zhì)機(jī)，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（德國IKA）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：稱取10 mg咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用丙酮溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用丙酮再次稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2, 4, 6-三氯苯酚工作液：稱取10 mg 2, 4, 6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用丙酮溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用丙酮再次稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的2, 4, 6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 水果儲備基質(zhì)液

分別稱取5份40 g蘋果試樣于5個100 mL的平底燒杯中，各加入50 mL的乙腈，勻漿機(jī)高速勻漿2 min，過濾，收集于裝有5 g氯化鈉的100 mL具塞比色管中，蓋上蓋子，劇烈振蕩1 min，靜置30 min，從比色管中吸取上層溶液于250 mL的平底燒杯中，搖勻，備用。

1.2.3 GC色譜條件

檢測方法采用GC-ECD法，色譜柱采用DB-5（30 m×0.320 mm×0.25 μm）的彈性石英毛細(xì)管柱。儀器檢測條件：柱溫70 ℃以40 ℃/min的速度升溫到245℃（保留5 min）；進(jìn)樣口溫度260 ℃；ECD溫度300℃；分流進(jìn)樣，分流比40∶1；色譜柱的載氣氣體為氮?dú)?，流?.5 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確吸取0.25，0.50，1.0，2.0和3.0 mL咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)工作液于水解試管中，氮吹濃縮近干，加入5 g吡啶鹽酸鹽，水解方法、凈化方法按照最優(yōu)方法進(jìn)行，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 對前處理凈化方式優(yōu)化分析

分3組，每組各取6個50 mL平底燒杯并分別加入10 mL儲備基質(zhì)液，然后在燒杯中分別加入1.0 mL 1.0 mg/L的2, 4, 6-三氯苯酚工作液（模擬咪鮮胺已完全水解），在振蕩器上混勻，放在氮吹儀上濃縮近干，待用。

1) 硫酸的凈化方法：將上述燒杯用20 mL正己烷分?jǐn)?shù)次沖洗并全部轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入5 mL硫酸，振蕩1 min，靜止分層后，棄去硫酸，重復(fù)3次。然后用蒸餾水洗滌有機(jī)相中的殘留硫酸，洗滌至中性，收集有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉脫水干燥后濃縮低于5 mL，并用正己烷定容至5 mL，上機(jī)測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 利用濃硫酸進(jìn)行凈化的咪鮮胺殘留量色譜圖

2) PSA 100 mg+C18100 mg+MgSO4300 mg QuECh-ERS凈化管的凈化方法：將上述燒杯用正己烷分?jǐn)?shù)次洗滌燒杯并全部轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶，并定容至5 mL。然后全部轉(zhuǎn)移到裝有PSA 100 mg+C18100 mg+MgSO4300 mg的QuEChERS凈化管中凈化，上機(jī)測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 利用凈化管進(jìn)行凈化的咪鮮胺殘留量色譜圖

3) 弗羅里硅土柱的凈化方法：將上述燒杯分?jǐn)?shù)次加入5 mL正己烷，并全部轉(zhuǎn)移到弗羅里硅土柱上（已用洗脫液活化），棄去濾液，用25 mL丙酮-正己烷（90∶10，V/V）洗脫溶劑洗脫，用25 mL帶刻度試管接收濾液，氮吹濃縮低于5 mL，最后用正己烷定容至5 mL，上機(jī)測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 用弗羅里硅土柱進(jìn)行凈化的咪鮮胺殘留量色譜圖

經(jīng)計算，2, 4, 6-三氯苯酚回收率得到的結(jié)果如表1所示。由圖譜和回收率計算結(jié)果可知，QuEChERS凈化管的填料對樣品中2, 4, 6-三氯苯酚的吸附作用很強(qiáng)，能把試樣中大部分2, 4, 6-三氯苯酚吸附在凈化管中，并且對于其他雜峰的凈化效果不顯著，甚至是沒有得到凈化效果，影響咪鮮胺最后的定量計算，故排除使用QuEChERS凈化管的使用；而濃硫酸和弗羅里硅土柱兩種的凈化效果能達(dá)到檢測要求，回收率均在90%以上，但凈化過程使用濃硫酸，容易發(fā)生危險，而弗羅里硅土柱凈化則使用過程相對簡單，不會對實(shí)驗人員造成潛在的危險以及在之后調(diào)節(jié)pH的不確定性也可以避免。故使用弗羅里硅土柱作為凈化的裝置。

表1 不同凈化方法下的2, 4, 6-三氯苯酚回收率 %

2.2 對洗脫溶劑優(yōu)化分析

分3組，每組各取6個50 mL平底燒杯并分別加入10 mL儲備基質(zhì)液，然后在燒杯中分別加入1.0 mL 1.0 mg/L的2, 4, 6-三氯苯酚工作液（模擬咪鮮胺已完全水解），在振蕩器上混勻，放在氮吹儀上濃縮近干，加入5 mL正己烷，蓋上蠟?zāi)?，待用?/p>

根據(jù)2.1優(yōu)化，將弗羅里硅土柱用5 mL表2中不同配比洗脫液進(jìn)行條件活化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時，馬上倒入上述樣品溶液，用25 mL的具刻度試管收集洗脫液，分別用25 mL相同配比的溶液沖洗燒杯后洗脫凈化柱。將裝有洗脫液的試管置于氮吹儀，在50 ℃水浴中濃縮近干，用正己烷準(zhǔn)確定容至5 mL，混勻，待測，結(jié)果如表2所示。

結(jié)果顯示，在丙酮與正己烷的配比是95∶5（V/V）和90∶10（V/V）及丙酮與二氯甲烷的配比是95∶5（V/V）時，2, 4, 6-三氯苯酚幾乎能全部被洗脫下來，其回收率均在90%以上，均滿足對檢測的要求。但是95∶5（V/V）的丙酮+二氯甲烷同時會對雜質(zhì)的回收率也明顯增加，特別對咪鮮胺臨近雜峰的洗脫，此雜峰會影響咪鮮胺的的定量檢測，而在95∶5（V/V）和90∶10（V/V）的丙酮+正己烷洗脫溶劑中，由于丙酮價格比正己烷的高，為降低檢測成本，選擇90∶10（V/V）的丙酮+正己烷相對合適。

表2 不同洗脫溶劑的配比下2, 4, 6-三氯苯酚平均回收率 %

2.3 對水解裝置優(yōu)化分析

分3組，每組各取6支帶具塞刻度的25 mL水解試管，加入1.0 mL咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，氮吹濃縮近干，加入5 g吡啶鹽酸鹽，按照表3中的水解條件進(jìn)行水解，冷卻至室溫后，加入適量的水溶解吡啶鹽酸鹽，并全部轉(zhuǎn)移到250 mL的分液漏斗中，試管用50 mL水分?jǐn)?shù)次沖洗并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，石油醚萃取2次（每次50 mL），棄去水相，合并有機(jī)相；濃縮近干，凈化方法按照2.1、2.2優(yōu)化出的最優(yōu)方法進(jìn)行。

經(jīng)多次反復(fù)試驗，在沙浴與25 mL的水解試管裝置下，一個砂浴鍋能同時加熱20～30個試樣，同時進(jìn)行水解，完全可以進(jìn)行大批量處理樣品。水解過程并沒有沸騰現(xiàn)象，安全可靠。同時，反應(yīng)后的試管容易清洗，能大大增加工作效率。其余方式操作繁瑣，不利于檢測多個樣品，不能提高處理效率。

表3 水解裝置及條件表

2.4 對提取溶液優(yōu)化分析

分3組，分別稱取40 g蘋果試樣于250 mL的平底燒杯中，加入1 mL 1.0 mg/L的咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照表5設(shè)計對應(yīng)加入各種用量的溶劑，并在勻漿機(jī)上高速勻漿2 min，過濾，收集濾液于裝有5 g氯化鈉的100 mL具塞試管中，蓋上蓋子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使之分層，吸取20 mL上層溶液于25 mL的帶刻度的試管中，氮吹儀上濃縮近干；加入5 g吡啶鹽酸鹽，水解方法使用按照2.3篩選出的最佳水解裝置進(jìn)行水解，水解1.5 h；凈化方法按照2.1、2.2優(yōu)化出的最優(yōu)方法進(jìn)行，上機(jī)待測，咪鮮胺回收率結(jié)果見表4。

NY/T 1456—2007中前處理提取液是用80 mL丙酮，并且需要浸泡過夜后仍需要振蕩60 min，試驗時間長，不便于檢測短時高效的要求。上述結(jié)果表明丙酮和乙腈在適當(dāng)?shù)捏w積中均能滿足檢測要求，而乙腈的提取回收率均在90%以上，溶劑用量各水平差異不明顯。故使用乙腈作為提取溶劑，其用量為50 mL。

表4 不同提取溶劑試驗下咪鮮胺平均回收率 %

2.5 方法的線性范圍和檢出限

將1.2.4配制好的咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)曲線按照上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行處理進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4）。線性方程為y=12 991.72x-118.34，其相關(guān)性r=0.999 53，這說明在0.05～0.6 mg/L線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。通過實(shí)際低濃度添加試驗，當(dāng)信噪比等于3時，咪鮮胺的檢出限為0.005 mg/kg，滿足試驗要求。

圖4 咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.6 方法的回收率和精密度

按照上述優(yōu)化后的條件，對蘋果、葡萄、西瓜、柑橘4種樣品分別添加0.05，0.20和0.40 mg/kg三個濃度水平，做加標(biāo)回收試驗，每個濃度6平行，結(jié)果見表5。咪鮮胺的平均回收為87.2%～101.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～5.5%。

表5 4類蔬果在3個添加水平下的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.7 方法在實(shí)際樣品上的應(yīng)用

在廣州市各大市場上隨機(jī)抽取橙子、桃子、草莓、葡萄、西瓜、蘋果等水果，共109批次，按照優(yōu)化后的試驗條件，每批次3平行進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示共21批次檢出咪鮮胺及其代謝物，其中葡萄與柑橘類檢出率最高。其濃度范圍在0.011 1～0.291 mg/kg之間，RSD范圍在0.9%～7.2%之間。

圖5 葡萄陽性樣品色譜圖

圖6 0.2 mg/L 2, 4, 6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)色譜圖

3 結(jié)論

此次試驗建立在GC-ECD檢測器的基礎(chǔ)上。經(jīng)試驗驗證，測定水果中咪鮮胺殘留量的前處理方法優(yōu)化為：稱取40 g試樣于250 mL燒杯中，加入50 mL乙腈，高速均質(zhì)2 min，過濾；收集濾液于裝有5 g氯化鈉的100 mL具塞試管中，蓋上蓋子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使之分層，吸取20 mL上層溶液于25 mL的帶刻度的水解試管中，氮吹濃縮近干后加入5 g吡啶鹽酸鹽，置于210～240 ℃的沙浴中水解1.5 h；冷卻后，加入10 mL蒸餾水使吡啶鹽酸鹽溶解，并用50 mL蒸餾水分次沖洗水解管轉(zhuǎn)移到250 mL分液漏斗中，用石油醚萃取2次（每次50 mL），合并有機(jī)相；將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到100 mL燒杯中，濃縮至干，用10 mL正己烷分次洗燒杯，溶液轉(zhuǎn)移到經(jīng)丙酮-正己烷混合溶液（90∶10，V/V）活化的弗羅里硅土柱，棄去濾液，用25 mL丙酮-正己烷混合溶液（90∶10，V/V）分?jǐn)?shù)次洗脫，收集濾液，氮吹并定容5 mL，供測定。該前處理方法在保證符合檢測要求的基礎(chǔ)上，簡化了實(shí)驗步驟，優(yōu)化了實(shí)驗的條件，能同時檢測多個樣品，既縮短檢測的時間，又節(jié)省成本費(fèi)用，安全可靠，方法簡單，且靈敏度高，適用于批量水果樣品中咪鮮胺及其代謝物殘留的定性和定量分析。