姜翠翠，董舒梅，邱松山*，周英彪

廣東石油化工學院果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開發(fā)中心（茂名 525000）

糖尿病已成為嚴重威脅人類健康的三大慢性疾病之一[1-2]。在治療2型糖尿病的藥物中，以阿卡波糖為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑通過延緩腸道對碳水化合物的消化吸收，進而降低餐后血糖濃度，從而達到對血糖的控制[3]。但該類藥物常會引起腹瀉、胃腸脹氣、腹痛等不良反應(yīng)[4]，因而從天然藥用植物中尋找和開發(fā)能有效治療糖尿病的藥物已成為新的研究熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)很多黃酮糖苷類天然產(chǎn)物具有較好的降糖作用，Ezzat等[5]對α-葡萄糖苷酶抑制劑進行研究，結(jié)果表明在測定條件下所測試的黃酮類化合物比陽性對照阿卡波糖對抑制α-葡萄糖苷酶活性更有效；Chen等[6]研究表明微囊藻葉中三種黃酮苷類化合物對α-葡萄糖苷酶均有較好的抑制作用，提示微生菌葉是開發(fā)中草藥抗糖尿病藥物的候選藥物；Nguyen等[7]通過試驗發(fā)現(xiàn)高粱籽粒中黃酮苷對血凝有潛在抑制作用及對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用，其富含黃酮類化合物的提取物可視為對糖尿病具有有益作用的功能性食品。

化橘紅由蕓香科植物化州柚或柚的接近成熟或未成熟的外層果皮經(jīng)干燥加工而來，素有“南方人參”之稱，研究表明化橘紅富含多糖、黃酮、香豆素等多種生物活性成分，藥用價值較高[8-9]，其中柚皮苷類化合物是化橘紅的主要有效活性成分[10]，具有抑菌[11]、抗氧化[12]、抗病毒[13]等生物活性?；偌t中的黃酮類物質(zhì)主要是柚皮苷、野漆樹苷及新橙皮苷等物質(zhì)，此類物質(zhì)一般以C6—C3—C6為基本碳架，分子中有1個酮式羰基結(jié)構(gòu)，分子上的酚羥基數(shù)目及位置對其物質(zhì)的生物活性有較大影響[14]。關(guān)于化橘紅中的柚皮苷抗氧化活性研究報道較多，而抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究較少，試驗以化橘紅柚皮苷為研究對象，采用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率并分析其抑制類型，考察反應(yīng)時間對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響，同時測定其清除DPPH自由基能力，以期為化橘紅柚皮苷進一步開發(fā)功能食品或藥品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化橘紅柚皮苷的制備

柚皮苷的制備參考文獻[15]的方法進行，有改動。取產(chǎn)自廣東化州楊梅鎮(zhèn)經(jīng)干燥的化橘紅，隔水蒸軟切片，粉碎，過40目篩，備用。取100 g過篩粉末，加入2 L 50%乙醇，超聲波輔助萃取50 min，超聲功率180 W，在60 ℃條件下提取1 h，萃取結(jié)束后過濾，晾干的濾渣再加入1 L 50%乙醇提取1 h，過濾收集濾液，合并2次濾液，減壓濃縮至200 mL，離心除去雜質(zhì)，在清液中加入95%乙醇進行醇沉，0 ℃靜置24 h，過濾，冷凍干燥得精制柚皮苷，經(jīng)測定純度為92.5%，備用。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.20，美國Sigma公司）；4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，Mym Biologigal Technology Company）；阿卡波糖（Acarbose，50 mg/片，德國拜耳醫(yī)藥公司）；碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉等（均為國產(chǎn)分析純）；超純水。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

HH-A型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；UV-5100B紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；DGG-916A恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；NRY-1102C立式恒溫搖床（上海南榮實驗室設(shè)備有限公司）；ME104型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；VC890C+數(shù)字多用表（西安北成電子有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗

參考程艷剛等[16]的方法進行，有改動。以PNPG為底物，利用α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG產(chǎn)生對硝基酚（PNP），以一定時間內(nèi)反應(yīng)體系中PNP含量變化來計算化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。以0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（PBS，pH 6.8）為溶劑，分別配制0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和2.5 mmol/L底物PNPG溶液，配制樣品濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10和0.12 mg/mL，備用。具體反應(yīng)體系：分別吸取1 500 μL pH 6.8的0.1 mol/L的PBS及250 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液于試管中，加入250 μL不同濃度的樣品溶液，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)10 min，加入250 μL 2.5 mmoL/L的PNPG溶液啟動反應(yīng)，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)20 min，加入1 000 μL 0.2 moL·L-1的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，并于405 nm波長下測定吸光度，記作A樣品。以PBS代替樣品，其它條件同A樣品，記作A對照。以PBS代替酶，其它條件同A樣品，記作A空白。以Acarbose為陽性對照，重復(fù)測定3次取平均值；根據(jù)式（1）計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率；應(yīng)用SPSS軟件計算樣品與Acarbose的IC50。

1.2.2 反應(yīng)時間對α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗

在1.2.1的反應(yīng)體系中加入相應(yīng)的試劑，分別設(shè)定反應(yīng)過程中的反應(yīng)時間5，10，15，20，25和30 min，終止反應(yīng)后于405 nm處測定吸光度OD，根據(jù)式（1）計算抑制率，比較不同反應(yīng)時間化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性抑制的影響。

1.2.3 抑制α-葡萄糖苷酶活性的動力學試驗

在測定體系中保持α-葡萄糖苷酶濃度（0.2 U/mL）不變，改變PNPG濃度，分別設(shè)置5個不同PNPG濃度（1.0，1.5，2.0，2.5和5.0 mmol/L），3個不同化橘紅柚皮苷樣品濃度（0，0.04和0.08 mg/mL），按1.2.1 的方法測定吸光度，以底物濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標，以反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標，經(jīng)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，探討化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶作用分析

底物PNPG濃度（2.5 mmoL/L）不變，設(shè)置6個不同的α-葡萄糖苷酶濃度（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 U/mL），3個不同化橘紅柚皮苷樣品濃度（0，0.04和0.08 mg/mL），按1.2.1的方法測定，以酶濃度為橫坐標，反應(yīng)速率為縱坐標，探討柚皮苷類物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆。

1.3 化橘紅柚皮苷清除DPPH·能力

參考Bajpai等[17]清除DPPH自由基的方法，有改動，分析柚皮苷樣品對DPPH自由基的清除能力。取6支試管，分別加入2 mL 0.02 mmoI/L DPPH·甲醇溶液置于10 mL的試管中，依次加入2 mL濃度為0，0.02，0.04，0.06和0.08 mg/mL的柚皮苷樣品溶液，迅速混勻，避光37 ℃溫水浴30 min，于波長517 nm處測定吸光度，根據(jù)式（2）計算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為空白對照樣品的吸光度；AX為待測溶液樣品的吸光度；AX0為樣品溶液加甲醇的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3遍，結(jié)果表示為平均值±標準偏差，應(yīng)用SPSS軟件通過單因素方差（One-way ANOVA）分析進行多組間比較，p＜0.05則認為樣品間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力

采用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型檢測柚皮苷類物質(zhì)對α-葡萄糖酶活性的抑制能力，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在0.02～0.12 mg/mL濃度范圍內(nèi)化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度升高而逐漸增加，其抑制活性呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。Peng等[18]研究山奈酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制機理，結(jié)果表明山奈酚能夠插入α-葡萄糖苷酶的活性位點，占據(jù)酶的催化中心，導(dǎo)致PNPG底物無法進入并誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶的構(gòu)象變化。IC50值表示化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶抑制的能力，IC50值越小其抑制效果越好，通過回歸分析可知化橘紅柚皮苷與阿卡波糖的IC50分別為0.008和0.026 mg/mL，表明化橘紅柚皮苷具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶活性，同時其抑制活性優(yōu)于陽性對照阿卡波糖（p＜0.05），這與文獻[18]報道的結(jié)果比較一致，柚皮苷分子具有類似的酚羥基及分子結(jié)構(gòu)，柚皮苷分子可能是通過抑制α-葡萄糖苷酶活性來實現(xiàn)降血糖功效的。

圖1 化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.2 反應(yīng)時間對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用影響

探討不同作用時間柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，確定化橘紅柚皮苷對酶活性的抑制是否具有時間依賴性，結(jié)果如圖2所示。

化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用在前15 min，隨時間增加其抑制率明顯增加，但在15～20 min以后，其抑制率隨時間增加而趨于平緩，表明化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與作用時間有關(guān)，在20 min時其抑制率達到最大，抑制作用具有一定時間依賴性，這與文獻報道[19]的結(jié)果比較一致。

2.3 柚皮苷類物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型

根據(jù)抑制劑與底物的結(jié)合關(guān)系，抑制類型可以分為3種：競爭性抑制、反競爭性抑制和非競爭性抑制。化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，基于不同濃度樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制數(shù)據(jù)進行線性回歸，無抑制劑組的線性回歸方程為：y=8.731 0x+4.891 0。0.04 mg/mL抑制劑組的線性回歸方程為：y=14.627 0x+4.824 7。0.08 mg/mL抑制劑組的線性回歸方程為：y=21.124 0x+4.879 8。R2均大于0.998 7。由線性回歸方程可知隨著化橘紅柚皮苷質(zhì)量濃度的增大，直線的橫軸截距變小，而縱軸的截距固定不變，即Km變大，Vm不變；底物濃度相同時，抑制劑濃度從0 mg/mL增加到0.08 mg/mL，反應(yīng)速率降低。由此可推斷化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為競爭性抑制，這與文獻[20]報道的結(jié)果比較一致。

圖2 不同時間柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

圖3 柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用曲線

2.4 柚皮苷類物質(zhì)的抑制作用的可逆性分析

采用1.2.4的方法，進一步判斷柚皮苷的抑制作用是否可逆，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在測定酶活體系中加入不同質(zhì)量濃度的化橘紅柚皮苷類物質(zhì)后，所得的直線均通過原點，且加入的化橘紅柚皮苷質(zhì)量濃度越大，直線斜率越低；由此可以推測化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的，這與文獻[21]報道的結(jié)果較為一致。

尋找有效的天然提取物作為α-葡萄糖苷酶抵制劑具有重要的意義，研究表明天然產(chǎn)物中的黃酮類物質(zhì)對糖尿病及并發(fā)癥具有積極的防治作用，柚皮苷屬于黃酮中的一種活性物質(zhì)，柚皮苷類物質(zhì)不但具有顯著的抗氧化、清除自由基的能力，還具較強的抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，研究表明楊梅中的黃酮類化合物與α-葡萄糖苷酶的相互作用力主要是疏水相互作用，通過混合型抑制表現(xiàn)較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，從而降低血糖值[3]，地錦草總黃酮對α-葡萄糖苷酶具有顯著抑制作用，且其抑制活性呈現(xiàn)一定的劑量依賴[16]，另有研究表明五味子中總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制活性約60%，通過競爭抑制調(diào)節(jié)控制血糖的作用[21]，化橘紅柚皮苷分子中有類似的酮式羰基結(jié)構(gòu)，分子上的酚羥基位置與數(shù)目對α-葡萄糖苷酶的抑制活性影響較大[14]，碳原子的游離羥基可增強其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，因此化橘紅柚皮苷可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的良好來源。

圖4 化橘紅柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的可逆性分析

2.5 化橘紅柚皮苷對DPPH自由基清除能力

采用1.3的方法比較柚皮苷和抗壞血酸對DPPH自由基清除能力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 柚皮苷和抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力比較

從圖5可知，隨著柚皮苷濃度升高，樣品對DPPH自由基清除能力增強（p＜0.05），但在低濃度下柚皮苷對DPPH自由基的清除能力不明顯，其對自由基清除能力低于抗壞血酸，質(zhì)量濃度0.08 mg/mL時，其DPPH自由基清除率達到73.6%，高于相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力，表明0.08 mg/mL濃度的柚皮苷具有較好的DPPH自由基清除能力，這與文獻[17]的報道較為一致，因此可進一步開發(fā)柚皮苷的抗氧化功效。

3 結(jié)論

化橘紅中的黃酮類物質(zhì)主要是柚皮苷、新橙皮苷及野漆樹苷等，此類物質(zhì)分子中有酮式羰基結(jié)構(gòu)，分子上的酚羥基位置及數(shù)目對其抑制α-葡萄糖苷酶的活性有較大影響。試驗結(jié)果表明化橘紅中的柚皮苷對α-葡萄糖苷酶活性具有較強的抑制作用，其抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。抑制曲線試驗表明最大反應(yīng)速度隨化橘紅柚皮苷質(zhì)量濃度的變化而變化，柚皮苷類物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用優(yōu)于阿卡波糖，其對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50為0.008 mg/mL，陽性對照物阿卡波糖的IC50為0.026 mg/mL，且對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭可逆型，同時0.08 mg/mL濃度的柚皮苷具有較強的DPPH自由基清除能力，因此化橘紅可作為天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑的良好來源，這為化橘紅柚皮苷的降血糖及抗氧化功能食品或藥品的開發(fā)及利用提供思路。