楊婧娟，趙聲蘭，馬雅鴿，楊薇，陳偉，張希*

云南中醫(yī)藥大學(xué)（昆明 650500）

近年來，心血管疾病已成為現(xiàn)代社會威脅人類健康的頭號殺手，合理選擇天然藥用資源并開發(fā)為保護心血管的健康產(chǎn)品有巨大的經(jīng)濟和社會價值。黃精是我國傳統(tǒng)藥食兩用資源，含有黃精多糖、皂苷、黃酮、生物堿等活性成分，有良好的降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等功效[1]，極具開發(fā)價值。

然而，生黃精具有刺激性，表現(xiàn)為麻舌感、刺激咽喉等，不適宜直接食用，因而影響其在大眾日常保健中的應(yīng)用。試驗采用發(fā)酵方法對黃精先進行預(yù)加工，利用微生物的生物轉(zhuǎn)化作用使黃精中關(guān)聯(lián)化學(xué)成分發(fā)生組分轉(zhuǎn)化或結(jié)構(gòu)變化[2-4]，從而降低其刺激性，甚至使某些功能活性增強[5-6]。以發(fā)酵加工后的黃精為主要原料，復(fù)配枸杞、陳皮、綠茶為輔料進一步制成袋泡茶。枸杞富含枸杞多糖、黃酮類、生物堿等活性成分[7]，陳皮中有豐富的黃酮類化合物如蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和揮發(fā)油等[8]，綠茶中也含有豐富的多酚類物質(zhì)。研究顯示，黃酮類化合物可通過抑制脂質(zhì)過氧化、下調(diào)炎癥因子、激活A(yù)MPK和轉(zhuǎn)錄因子-κB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等發(fā)揮保護心血管的作用[9]；茶多酚能通過改善內(nèi)皮功能、抗炎等途徑有效預(yù)防動脈粥樣硬化[10]。因此，將這些天然植物資源復(fù)合使用，能協(xié)同發(fā)揮保護心血管健康的作用，而且制備為方便的袋泡茶形式，對于滿足大眾追求“綠色、天然、健康、便捷”的日常保健需求具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精根莖、枸杞、陳皮、綠茶（60 ℃烘干后粉碎過40目篩備用），云南新世紀藥業(yè)有限公司；凸圓靈芝（白芝）GIM5.6，廣東省微生物菌種保藏中心；兔角膜上皮細胞（SIRC）人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC），華拓生物科技有限公司；胎牛血清，杭州四季青試劑公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；蘆丁、沒食子酸、雙抗、胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；抽線玉米纖維茶包袋，上海愛茶科技有限公司；所用其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250），上海醫(yī)療器械五廠；超凈工作臺（SW-CJ-2D），蘇州凈化設(shè)備有限公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher；倒置顯微鏡，日本Olympus；生物安全柜，蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標儀（INFINITE M200 PRO），瑞士TECAN；紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃精袋泡茶的制備

1.3.1.1 黃精的發(fā)酵加工

取一定量干燥粉碎生黃精與輔料麩皮按質(zhì)量比3∶1比例混勻后121 ℃滅菌20 min，接種10%凸圓靈芝液體種子，于28 ℃固態(tài)發(fā)酵12 d。發(fā)酵結(jié)束后于60 ℃干燥12 h即得發(fā)酵黃精樣。1.3.1.2 黃精袋泡茶的復(fù)配

以發(fā)酵黃精為主要原料，按照適宜比例復(fù)配枸杞、陳皮、綠茶為輔料，混合均勻后分裝入玉米纖維茶包袋，每袋含內(nèi)容物4 g。

1.3.2 黃精袋泡茶的配方優(yōu)化設(shè)計

試驗以多糖、茶多酚、黃酮含量和感官評分為評價指標，采用試驗設(shè)計軟件Design Expert中混料設(shè)計D-Optional方法[11]對黃精袋泡茶的配方進行優(yōu)化，確定發(fā)酵黃精、枸杞、陳皮和綠茶的最佳添加比例。設(shè)定黃精發(fā)酵產(chǎn)物在配方中所占百分比為50%～60%，其他各成分在配方中所占百分比為5%～20%進行試驗。

1.3.3 黃精的刺激性評價

應(yīng)用兔角膜上皮細胞（SIRC）短時暴露法評價黃精的刺激性[12-13]。選擇對數(shù)生長期的SIRC細胞，按照105個/孔密度接種于96孔板，待細胞生長融合后，每孔添加受試物100 μL處理細胞5 min（每個樣品做6個復(fù)孔），然后移除受試物并用PBS洗3次，在每孔中加入H-DMEM培養(yǎng)基100 μL和MTS溶液10 μL，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 左右，于490 nm測定吸光度，計算細胞存活率。其中，樣品設(shè)置生黃精樣和發(fā)酵黃精樣作對比，樣品前處理步驟為：分別取5 g干燥粉碎生黃精和發(fā)酵黃精，按照料水比1∶20（g/mL）用蒸餾水于95 ℃回流浸提，收集上清液，定容至500 mL。同時設(shè)置陽性對照為具有明確眼刺激性的十二烷基硫酸鈉（SDS，5 mg/mL），陰性對照甘油（10 mg/mL）。

1.3.4 黃精抗氧化損傷活性評價

由于血管內(nèi)皮細胞受損，發(fā)生功能障礙是出現(xiàn)動脈粥樣硬化等心血管疾病的始動環(huán)節(jié)，因此，保護血管內(nèi)皮細胞是預(yù)防相關(guān)疾病的關(guān)鍵[14]。參照文獻[15]方法以黃精對過氧化氫氧化損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）的保護作用來評價其抗氧化損傷活性。其中，測試分組為：過氧化氫氧化損傷模型組：以完全培養(yǎng)液（89%高糖DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%雙抗）將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入H2O2溶液并使其在孔內(nèi)終濃度為1.1 mmol/L（建模試驗篩選濃度），誘導(dǎo)損傷4 h；黃精樣品組：分別添加生黃精和發(fā)酵黃精處理液（分別取5 g干燥粉碎生黃精和發(fā)酵黃精，以蒸餾水于95 ℃回流浸提，收集上清液，定容至250 mL），調(diào)整樣液在孔內(nèi)濃度為原料質(zhì)量濃度10 mg/mL，與細胞共同孵育24后，再以模型濃度加入H2O2誘導(dǎo)損傷4 h；正常對照組：用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞，每隔24 h換1次液。最后將各組以MTS法檢測細胞存活率。

1.3.5 黃精袋泡茶的主要活性成分含量測定

多糖含量測定：以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法[16]測定多糖含量，繪制標準曲線（y=52.657x-0.040 4，R2=0.996 3）。取制備好的袋茶（4 g/袋），加入200 mL 90 ℃純凈水浸泡15 min。取100 mL茶湯加入無水乙醇使含醇量達80%，于4 ℃靜置過夜，抽濾收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗后于40 ℃烘干得粗多糖，用蒸餾水溶解并定容至100 mL。按標準物質(zhì)操作步驟進行樣品測定，計算袋泡茶中多糖含量。

黃酮含量測定：以蘆丁為標準品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[17]測定黃酮含量，繪制標準曲線（y=5.845x+0.002 7，R2=0.999 6）。取制備好的袋茶（4 g/袋），加入200 mL 90 ℃純凈水浸泡15 min。取50 mL茶湯以蒸餾水定容至100 mL，以3 500 r/min離心10 min，取上清液按標準物質(zhì)操作步驟進行樣品測定，計算袋泡茶中黃酮含量。

茶多酚含量測定：以沒食子酸為標準品，按照GB/T 8313—2018測定茶多酚含量，繪制標準曲線（y=0.003 9x-0.012，R2=0.997 8）。同上處理袋茶得上清液按標準品操作步驟進行樣品測定，計算袋泡茶中茶多酚含量。

1.3.6 黃精袋泡茶的感官評價黃精袋泡茶感官評分標準見表1。

表1 黃精袋泡茶感官評分標準

取制備好的袋泡茶以90 ℃蒸餾水浸泡15 min后，組織30名品評員分別從湯色、香氣和滋味進行品評打分，滿分為100分。感官評分標準參照GB/T 24690—2018《袋泡茶》制定，并結(jié)合產(chǎn)品特點作適當(dāng)修改。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對黃精刺激性和抗氧化損傷活性的影響

圖1結(jié)果顯示，生黃精相比于陰性對照甘油，表現(xiàn)出一定的刺激性，SIRC細胞經(jīng)生黃精樣處理后存活率為（68.55%±5.23%），但遠低于陽性對照SDS（細胞存活率11.37%±3.75%）。黃精經(jīng)凸圓靈芝發(fā)酵后，刺激性得到顯著改善，表現(xiàn)為發(fā)酵樣品處理SIRC細胞后存活率提高到90.60%±3.55%；麻味消失，以熱水沖泡后還帶有淡淡清香味，口感甘醇。發(fā)酵還能提高黃精抗氧化損傷活性，對比過氧化氫損傷模型組（細胞存活率54.66%±4.12%），HUVEC細胞經(jīng)發(fā)酵黃精提前干預(yù)后存活率提高到78.13%±4.25%。從試驗結(jié)果可以看出，發(fā)酵處理對黃精起到了減毒（刺激性）增效的作用，這可能是由于發(fā)酵帶來的生物轉(zhuǎn)化作用，使其中的關(guān)鍵成分如多糖、皂苷等物質(zhì)的含量或是其結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息發(fā)生了變化，從而引起了刺激性和活性的轉(zhuǎn)變[18]。因此，發(fā)酵加工對于改善生黃精口感和活性具有重要意義。

2.2 黃精袋泡茶配方模型的建立與分析

黃精袋泡茶的配方設(shè)計和試驗結(jié)果見表2。以多糖含量、茶多酚含量、黃酮含量和感官評分作為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert軟件對表1的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，建立4個指標（Y多糖含量、Y茶多酚含量、Y黃酮含量、Y感官評分）的回歸模型，得到各回歸模型方程如下：

對模型方程進行方差分析，其中以茶多酚和黃酮含量為響應(yīng)值的二次模型和線性模型均呈極顯著水平（p＜0.01）。多糖含量、茶多酚含量、黃酮含量和感官評分4項指標的判定系數(shù)（R2）分別為0.914 6，0.908 7，0.886 2和0.925 0，表明試驗結(jié)果與模型擬合程度良好。

圖1 不同黃精樣品的刺激性和抗氧化損傷活性

表2 黃精袋泡茶的配方設(shè)計和試驗結(jié)果

2.3 配方各原料變化對活性成分含量和感官評分的影響

黃精袋茶的配方中共有4種成分，在等高線和二維曲面圖中固定其中一種成分，可以比較其他3種成分交互作用對指標的影響。其中，圖2～圖4表示各輔料的添加量對茶湯中活性成分含量的影響。圖2結(jié)果顯示，配方組成中適當(dāng)控制黃精的添加量，提高枸杞和陳皮的添加比例更有利于增加茶湯中多糖的溶出量。枸杞中含有豐富的枸杞多糖，含量超過50%[19]，因此其是復(fù)合袋茶中最主要的多糖貢獻組分。圖3結(jié)果顯示，響應(yīng)曲面隨著綠茶添加量增加的方向顯著往上傾斜，說明綠茶添加量對茶湯中茶多酚含量影響較強，在各原料中占主導(dǎo)地位，這與綠茶中含有豐富的茶多酚有關(guān)。圖4顯示黃酮含量隨著陳皮添加量的增加，有較為明顯的增幅。陳皮本身含豐富的黃酮類化合物如蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素等，增加其在配方中的比例會使茶湯中的黃酮含量相應(yīng)增高。

圖2 發(fā)酵黃精、枸杞、陳皮的交互作用對產(chǎn)品多糖含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

圖3 枸杞、陳皮、綠茶的交互作用對產(chǎn)品茶多酚含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

圖5 表示各輔料添加量對茶湯感官評分的影響。結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵黃精的添加量增加，感官評分明顯隨之增高；不斷提高輔料綠茶的添加量，感官評分降低；當(dāng)陳皮添加量在5%～15%左右，感官評分隨添加量增加而提高，但添加量超過15%水平再進一步提高，感官評分反而下降。黃精發(fā)酵后麻味消失，沖泡后茶湯中還帶有淡淡清香味，口感甘醇，增加發(fā)酵黃精的添加量對香氣和滋味有較好的提升作用。但由于復(fù)配的陳皮和枸杞均具有較強的特殊風(fēng)味，因此考慮復(fù)配后茶湯的混合口感，發(fā)酵黃精添加量也不宜過多。由于綠茶和陳皮泡水后帶有輕微的苦澀味，隨著添加量增加茶湯的澀味加重，感官評分有所降低，因此需控制其添加量，但陳皮由于還賦予茶湯特有的果香味，可以在適宜的比例（5%～15%）內(nèi)適當(dāng)提高其用量。

圖4 發(fā)酵黃精、枸杞、陳皮的交互作用對產(chǎn)品黃酮含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

圖5 發(fā)酵黃精、綠茶、陳皮的交互作用對產(chǎn)品感官品質(zhì)影響的等高線和響應(yīng)曲面

2.4 袋泡茶最優(yōu)配方的確定

袋泡茶配方的確定優(yōu)先考慮其保健功能，因此，在制備過程以最大程度獲得活性物質(zhì)（多糖、茶多酚和黃酮含量）為基礎(chǔ)，并盡可能使產(chǎn)品有良好的感官品質(zhì)。基于此目標對各指標進行權(quán)重系數(shù)確定，多糖、茶多酚和黃酮含量的權(quán)重系數(shù)均為0.3，感官指標權(quán)重系數(shù)為0.1，運用隸屬度綜合評分法[20]和賦予的權(quán)重進行加權(quán)求和得到各樣本的綜合評分見表3。其中隸屬度按公式計算：L=（Ci-Cmin）/（Cmax-Cmin）。式中，Ci為指標值；Cmin為指標最小值；Cmax為指標最大值。以各項指標的綜合評分作為目標參數(shù)，利用Design Expert軟件對綜合評分結(jié)進行二次多項回歸擬合，建立Y綜合評分的回歸模型，回歸模型方程如下：

對模型方程進行方差分析，結(jié)果見表4。黃精袋泡茶配方的二次模型達到顯著水平（p＜0.05），線性混合模型達到極顯著水平（p＜0.01），配方綜合評分的判定系數(shù)R2=0.916 0，說明模型擬合程度較好，能較好地表現(xiàn)考察指標和復(fù)配比例之間的關(guān)系，因此可以用該模型對袋泡茶的最優(yōu)配方進行分析和預(yù)測。

表3 黃精袋泡茶各指標的隸屬度和綜合評分

表4 黃精袋泡茶綜合評分的二次多項回歸模型方差分析

應(yīng)用軟件的最優(yōu)化功能得到黃精袋泡茶配方的最優(yōu)組合為：發(fā)酵黃精50.00%、枸杞11.59%、陳皮18.66%、綠茶19.75%。在此點預(yù)測所得茶包的綜合評分0.902 1，根據(jù)優(yōu)化后的配方進行驗證試驗，得到袋泡茶的各項指標值為多糖含量545.23 mg/g，茶多酚含量603.34 mg/g，黃酮含量38.78 mg/g，感官評分83.40分，綜合評分0.887 2分，與預(yù)測值基本接近，說明混料設(shè)計法在黃精袋泡茶配方設(shè)計和優(yōu)化中的應(yīng)用有效。

3 結(jié)論

試驗應(yīng)用發(fā)酵法對黃精預(yù)加工，經(jīng)凸圓靈芝固態(tài)發(fā)酵后，黃精的刺激性得到有效改善，對HUVEC人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用顯著提高，可用于保護心血管的功能性食品開發(fā)。應(yīng)用混料設(shè)計法研究了黃精袋泡茶的最優(yōu)配方，得到各原料添加的最優(yōu)比例：發(fā)酵黃精50.00%、枸杞11.59%、陳皮18.66%、綠茶19.75%。此配方下所得袋泡茶各項指標值為多糖含量545.23 mg/g，茶多酚含量603.34 mg/g，黃酮含量38.78 mg/g，感官評分83.40分。沖泡后茶湯金黃清透，帶有淡淡清香味，口感醇正，回味甘甜。