張晟，馬雪，李楊，郭麗*

綏化學院食品與制藥工程學院（綏化 152061）

五味子俗稱北五味子，為常用滋補強壯中藥，五味子中含有多糖、木質(zhì)素、揮發(fā)油等生物活性成分[1]。五味子提取物具有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)?、抗氧化、解毒等多種藥理作用，在醫(yī)藥上具有重要的應用價值[2-5]。隨著人們對五味子功效的認識，關于五味子產(chǎn)品的研究也越來越多，如五味子保健飲料[6]、果醬[7]、果醋[8]、果酒[9-10]等，相關的產(chǎn)品也逐年增多。因此，五味子加工過程中產(chǎn)生的大量果渣，而大部分果渣被丟棄，未得到充分利用，對環(huán)境造成嚴重影響。

低醇飲料是利用果蔬等為原料，通過酵母適當發(fā)酵而成的高營養(yǎng)活性飲料。在微生物及酶的作用下，許多活性因子在發(fā)酵的過程中得到釋放，目前在歐美一些發(fā)達國家，低醇飲料更是受到極大的歡迎[11-12]，相關產(chǎn)品也逐漸問世，但我國在以果蔬為原料發(fā)酵生產(chǎn)低醇飲料相對較少，而且國內(nèi)外關于五味子果渣低醇飲料開發(fā)和研究的文獻仍鮮見報道。

試驗以五味子果渣為原料，研究低醇飲料的發(fā)酵工藝與最佳參數(shù)，為五味子產(chǎn)品的深加工產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子果渣，新鮮五味子購自寧安市北域珍奇山林食品有限公司，壓榨后的果渣真空冷凍干燥，備用；釀酒酵母1012（Saccharomyces cerevisiae），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；甲醇（色譜純）、五味子酯甲（色譜純）、YPD培養(yǎng)基、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇、苯酚、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸，均購于哈爾濱盛世天澤生物科技有限公司；白砂糖，市售。

1.2 儀器與設備

TP310 pH分析儀，北京時代新維測控設備有限公司；DNP電熱恒溫培養(yǎng)箱，揚州恒都電子科技有限公司；九陽JYZ-V15榨汁機，九陽股份有限公司；阿貝折光儀，上海明茲精密儀器廠；8500紫外分光光度計，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；DZKW-S-4型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

五味子果渣→解凍→加水破碎→五味子汁→成分調(diào)整→加偏壓硫酸鉀→酵母活化→接種→恒溫發(fā)酵→終止發(fā)酵→壓榨→澄清→殺菌成分檢測→灌裝→成品

1.3.2 操作要點

將冷凍儲存的五味子果渣進行常溫解凍，按照1∶3的比例添加無菌飲用水，放入榨汁機中，打碎成漿，用碳酸氫鈉或檸檬酸調(diào)節(jié)pH（自然pH為3.3），添加2%白砂糖（根據(jù)預試驗，得到發(fā)酵液的酒度為1%vol），按100 mg/L加入偏壓硫酸鉀，12 h后加入活化好的酵母菌種子液（無菌條件下，從甘油培養(yǎng)基中取菌株一環(huán)，將其接入100 mL配制好的YPD液體培養(yǎng)基，設置恒溫培養(yǎng)條件：溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、培養(yǎng)時間12 h，得到活化的種子液），攪拌均勻后倒入發(fā)酵罐中于不同的溫度下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后進行壓榨，將皮渣進行分離，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液用0.45 μm濾膜微濾進行澄清處理，隨后在63 ℃水浴條件下殺菌30 min，放置常溫后進行成分的測定，得到成品。1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 初始pH對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調(diào)整糖度為2%，調(diào)節(jié)pH為3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，按照6%的接種量進行接種，在28 ℃條件下進行72 h的發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定五味子發(fā)酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.3.2 接種量對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調(diào)整糖度為2%，調(diào)節(jié)pH為4.0，按照2%，4%，6%，8%和10%的接種量進行接種，在28 ℃條件下進行72 h的發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定五味子發(fā)酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.3.3 發(fā)酵溫度對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調(diào)整糖度為2%，調(diào)節(jié)pH為4.0，按照6%的接種量進行接種，調(diào)整發(fā)酵溫度為22，25，28，31和34 ℃，發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束后測定五味子發(fā)酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.3.4 發(fā)酵時間對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調(diào)整糖度為2%，調(diào)節(jié)pH為4.0，按照6%的接種量進行接種，在28℃條件下進行24，48，72，96和120 h的發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定五味子發(fā)酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.4 五味子低醇飲料發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

利用響應曲面分析的方法優(yōu)化出其適合的發(fā)酵條件，采取初始pH、接種量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間為自變量，將感官綜合值作為R值，通過四因素三水平響應曲面設計，得出其最佳工藝條件，如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.3.5 理化指標的測定

pH采用pH分析儀測定；酒精度采用比重計法測定；含糖量采用手持折光儀測定；可滴定酸采用酸堿滴定法測定；還原糖含量采用斐林滴定法測定[13]；總木質(zhì)素采用比色法測定[14]；多糖采用苯酚-硫酸法測定[14]；花色苷參照劉長姣[15]和Pertuzatti等[16]的方法測定。

1.3.6 微生物指標的測定

參照GB/T 4789—2003[17]進行測定。

1.3.7 感官評價方法

請20位具有一定食品感官評定基礎的品嘗者對每一批五味子低醇發(fā)酵飲料進行感官評定[18]。滿分為100分，具體標準見表2。

表2 感官評分標準

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著pH的不斷增加，五味子低醇飲料的酒精度也隨之增加，當pH達到4.0時，酒精度達到最高，證明發(fā)酵最為充分。而后，隨著pH的繼續(xù)增加，其酒精度變化較緩慢。這是因為在較低的pH條件下，酵母菌的生長受到抑制，因此不利于其充分的發(fā)酵，而過高的pH會使得一些雜菌生長而消耗體系內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，使得酵母菌生長受限[19]；另外，過低的pH也會使得發(fā)酵飲料的口感過酸，影響飲料的口感；而較高的發(fā)酵初始pH會由于雜菌的生長產(chǎn)生不良異味，同樣會影響口感。因此選擇發(fā)酵pH 4.0為好。

圖1 初始pH對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

2.2 接種量對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

隨著接種量的增加，其酒精度也隨之增加，當接種量為6%時，其酒精度達到最大，而后隨著接種量的增加，酒精度變化不顯著。這是因為在較低的接種量時，發(fā)酵液中的糖分無法被充分利用，進而使得發(fā)酵不完全。當接種量較低時，由于發(fā)酵不完全，發(fā)酵飲料的醇香味不足，影響口感；若接種量過高時，酵母的生長和酵母自身的氣味同樣會影響發(fā)酵飲料的風味，因此當接種量為6%時，其感官評分最高。

圖2 接種量對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

2.3 發(fā)酵溫度對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

隨著發(fā)酵溫度的增加，其酒精度也隨之增加，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，酒精度達到最大，而后不發(fā)生改變。這是由于發(fā)酵過程中酵母菌將大部分可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇，溫度越高酵母的代謝速度越快。當發(fā)酵溫度較低時，酵母代謝速率較為緩慢，使得發(fā)酵不完全，醇香味變淡，因此口感不佳，而溫度過高時，產(chǎn)酸量越多，風味物質(zhì)形成較少[20]。因此，最佳發(fā)酵溫度控制在28 ℃。

2.4 發(fā)酵時間對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，其酒精度迅速增加；當達到72 h時，其酒精度達到最大，隨后酒精度不變。其感官評分為先增加后下降的趨勢，這是由于發(fā)酵時間過短，酵母自身生長繁殖、代謝產(chǎn)物較少，產(chǎn)生乙醇量低，進而醇香味不足；發(fā)酵時間長，五味子中的風味物質(zhì)會損失，果香味減弱，同時酸性物質(zhì)也會增加，影響產(chǎn)品的風味。發(fā)酵72 h時，為最佳發(fā)酵時間。

圖3 發(fā)酵溫度對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

圖4 發(fā)酵時間對五味子低醇飲料品質(zhì)的影響

2.5 五味子低醇飲料發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

其試驗方案與設計見表3和表4。

通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert進行數(shù)據(jù)分析，得到關于R的方程：

從表4可以看到，此方程極顯著（p＜0.000 1），且失擬項不顯著，證明試驗擬合出的效果接近于理論的結(jié)果，均方值R2=96.82%，說明此響應曲面模型能解釋96.82%的響應變化，R2Adj=93.65%，從相反的方向說明僅僅有6.358%的總變異是此模型無法預測的，達到了非常高的擬合程度。通過F值大小能判斷出各因素的影響大小，由高至低依次為B＞A＞C＞D，即接種量＞初始pH＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。

通過響應曲面模型可以得到，初始pH為4.02，酵母接種量為6.11%，發(fā)酵溫度為27.68 ℃，發(fā)酵時間為71.60 h，所得到的產(chǎn)品的感官評分達到94。結(jié)合實際生產(chǎn)中的工藝水平，調(diào)整到初始pH 4.0、酵母接種量6%、發(fā)酵溫度28 ℃、及發(fā)酵時間72 h。

表3 試驗方案及結(jié)果

表4 方差分析

為了驗證更為可靠的數(shù)據(jù)，采用上述的工藝條件進行三次驗證試驗，其感官評分結(jié)果所得到的平均值為93.33，與理論預測值相差0.67%。所以通過上述方法測定出的工藝條件是準確可靠的。

2.6 五味子果渣低醇飲料的品質(zhì)指標

2.6.1 感官指標

產(chǎn)品呈酒紅色，清亮，光澤透明，無沉淀現(xiàn)象；口感細膩均勻，風味平衡；具有清新的五味子果香和濃郁的發(fā)酵香味。

2.6.2 理化指標

五味子果渣低醇飲料的主要成分見表5。

圖5 兩因素交互作用對酒精度影響的響應面圖

表5 五味子果渣低醇飲料主要成分

2.6.3 微生物指標

細菌總數(shù)（CFU/mL）≤100；大腸桿菌（MPN/100 mL）≤3；致病菌不得檢出。

3 結(jié)論

通過單因素試驗與響應面試驗可以發(fā)現(xiàn)，初始pH、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對于五味子果渣低醇飲料的口感與酒精度有顯著的影響。五味子果渣經(jīng)過調(diào)節(jié)初始pH 4.0、酵母接種量6%、發(fā)酵溫度28 ℃及發(fā)酵時間72 h，所得到的產(chǎn)品的酒精度為1.20%vol。此飲料呈酒紅色，清亮，光澤透明、無沉淀現(xiàn)象；口感細膩均勻，風味平衡；具有清新的五味子果香和濃郁的發(fā)酵香味。