王菲菲，李棟，趙俊梅，牟德華, *

1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（石家莊 050000）；2. 河北省（承德）山楂產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（承德 067300）

山楂富含抗壞血酸、花青素和黃酮類化合物[1]，研究結(jié)果證實山楂中的這些活性物質(zhì)對心血管系統(tǒng)具有保護作用和治療作用，包括心血管保護、降血壓活性、降膽固醇血癥和降血脂作用等[2-4]。很多學(xué)者也已經(jīng)通過體內(nèi)體外試驗證明山楂多酚和黃酮具有顯著的抗氧化能力，可以顯著地降低大鼠血脂中的TC、LDL含量，并且對TG、HDL有調(diào)節(jié)作用[5-6]。目前，市面上山楂制品，包括山楂片、山楂罐頭、果丹皮、山楂汁、山楂酵素飲料等，但是山楂高附加值產(chǎn)品種類較少，基于山楂顯著的降血脂功效，開發(fā)新型山楂制品和山楂功能性產(chǎn)品具有很重要的現(xiàn)實意義。

山楂中果膠類物質(zhì)含量較高，為2%～4%，并且山楂果膠的黏度也比檸檬和蘋果果膠高得多[7]。高黏度果膠的存在使得山楂原液在噴霧干燥過程中極易產(chǎn)生粘壁現(xiàn)象，導(dǎo)致原料損失嚴(yán)重，在很大程度上阻礙了山楂的深加工[8-10]。

果膠酶是一類能夠催化果膠降解的復(fù)合酶。自然界中的果膠大都由半乳糖醛酸單元通過α-1, 4-糖苷鍵連接、聚合，甚至被甲酯化而形成[11-12]。果膠酶根據(jù)作用位點不同，可以將其分為原果膠酶、解聚酶、果膠酯酶、半乳糖醛酸酶等，其中原果膠酶能夠降解不溶性果膠，解聚酶作用于果膠結(jié)構(gòu)中的α-1, 4-糖苷鍵，果膠酯酶發(fā)揮脫甲酯作用，半乳糖醛酸酶則將果膠水解成為半乳糖醛酸單體[13]。在工業(yè)上，果膠酶常被用于生產(chǎn)果膠低聚糖[14]、果汁澄清[15]、果酒澄清[16]、果醋澄清[17]、脫除果膠[18]等。通過噴霧干燥的方式制備一種高附加值的山楂原粉，需要脫除山楂原液中的部分果膠。鑒于酶法脫膠高效性和專一性的特點，此次試驗采用特異性的果膠酶脫除山楂原液中的果膠。

1 材料與方法

1.1 材料

干山楂片，神威藥業(yè)（石家莊）中藥飲片有限公司。

1.2 試劑

氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈣，均為本地試劑公司生產(chǎn)的分析純試劑。Pectinex Yield MASH果膠酶，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司提供；裂解酶，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所提供；LALLZYMEEX果膠酶，法國Laffort公司；果膠酶，山東隆科特酶制劑有限公司提供。

1.3 儀器與設(shè)備

水浴鍋，上海勝啟儀器儀表有限公司；Sartorius水分測定儀，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DEL7A320 pH計，上海展儀儀器設(shè)備有限公司；Adventurer電子分析天平，美國奧豪斯儀器有限公司。

1.4 樣品的制備

取適量的干山楂片，按照料液比1∶10（g/mL）的比例向其中加入去離子水，在60 ℃水浴鍋中加熱提取2 h，冷卻，過濾，得到山楂原液。

1.5 果膠酶的篩選

已經(jīng)有研究報道，山楂果膠結(jié)構(gòu)主要為HG和RG-Ⅱ型[19]，根據(jù)不同種類的果膠酶作用位點的特異性，選用Pectinex Yield MASH果膠酶（半乳糖醛酸酶）、裂解酶、LALLZYMEEX果膠酶（纖維素酶）和果膠酶4種果膠水解酶，分別取0.5 mL 10 U/mL的果膠酶，加入到50 mL山楂原液中，在40 ℃水浴條件下酶解30 min，根據(jù)張方艷等[20]的方法分別測定酶解前后山楂果膠含量，酶的作用效果用果膠脫除率來表示。

1.6 果膠的測定

準(zhǔn)確移取25 mL濾液于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉，放置30 min，再加入50 mL 1 mol/L醋酸溶液，放置5 min后加入50 mL 2 mol/L氯化鋇溶液，放置30 min。加熱沸騰5 min后立即用稱量過干質(zhì)量的濾紙抽濾，用熱水洗滌至無氯根為止（用硝酸銀溶液檢查無白色沉淀），取出濾紙稱量干質(zhì)量。

1.7 果膠酶酶解單因素試驗

1.7.1 果膠酶添加量對果膠水解的效果的影響

取5份50 mL山楂原液，分別放在5個250 mL錐形瓶中，加入50 mL水，調(diào)節(jié)pH至4.0，向其中分別加入5，10，15，20和25 U Pectinex Yield MASH果膠酶，在40 ℃水浴加熱條件下酶解30 min，取出后加幾粒沸石，加熱煮沸1 h，并補充蒸發(fā)損失的水，冷卻后移入100 mL容量瓶中，定容后搖勻，抽濾，測果膠含量。

1.7.2 酶解時間對果膠水解效果的影響

取5份50 mL山楂原液，分別放在5個250 mL錐形瓶中，加入50 mL水，調(diào)節(jié)pH至4.0，向其中分別加入10 U Pectinex Yield MASH果膠酶，在40 ℃水浴加熱條件下分別酶解30，60，90，120和150 min，取出后加幾粒沸石加熱煮沸1 h，并補充蒸發(fā)損失的水，冷卻后移入100 mL容量瓶中，定容后搖勻，抽濾，測果膠含量。

1.7.3 酶解溫度對果膠水解效果的影響

取5份50 mL山楂原液，分別放在5個250 mL錐形瓶中，加入50 mL水，調(diào)節(jié)pH至4.0，向其中分別加入10 U Pectinex Yield MASH果膠酶，分別在20，30，40，50和60 ℃水浴加熱條件下酶解30 min，取出后加幾粒沸石加熱煮沸1 h，并補充蒸發(fā)損失的水，冷卻后移入100 mL容量瓶中，定容后搖勻，抽濾，測果膠含量。

1.8 果膠含量及果膠脫除率的計算方法

式中：G為濾渣質(zhì)量，g；W為樣品質(zhì)量，g；0.738 0為果膠酸鋇換算為果膠質(zhì)的系數(shù)。

式中：a為山楂原液果膠含量；b為脫膠處理后山楂原液果膠含量。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010，Design-Expert 6.0.10和Origin 8.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠酶的篩選

通過重量法測定果膠的百分含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同類型果膠酶的果膠脫除率

聚半乳糖醛酸酶（PG）對果膠結(jié)構(gòu)中的α-1, 4糖苷鍵具有酶解效果，可以隨機斷裂果膠主鏈內(nèi)部非酯化半乳糖醛酸間的α-1, 4糖苷鍵，產(chǎn)生不同聚合度的果膠分子[21]；而裂解酶（PL）是通過β-反式消除作用切割α-1, 4-糖苷鍵，只能對甲酯基旁邊的α-1, 4糖苷鍵具有酶解效果[22-23]；纖維素酶則通過水解多糖分子中的β-1, 4-糖苷鍵來達到水解多糖分子的效果。所選的四種商品酶均為復(fù)合酶，都具有總果膠酶活性、半乳糖醛酸酶活性、裂解酶活性和纖維素酶活性，它們對果膠的酶解效果也因不同配方果膠酶產(chǎn)生差異，根據(jù)這四種商品酶的最高酶活將其分為聚半乳糖醛酸酶、裂解酶、纖維素酶和果膠酶。

在加酶量和酶解時間相同的條件下，半乳糖醛酸酶活性較強的Pectinex Yield MASH果膠脫除率最高，達到89.13%，四種果膠酶的果膠脫除率在10%～90%之間不等，差異較為顯著，根據(jù)此次試驗?zāi)康模罱K選用果膠脫除率最高的Pectinex Yield MASH酶。

2.2 單因素試驗

2.2.1 果膠酶添加量對果膠脫除率的影響

從圖1可以看出，隨著果膠酶添加量的增大，山楂原液中果膠的脫除率總體呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。當(dāng)加酶量低于8 U時，曲線的斜率也隨加酶量的增大而增大，尤其是當(dāng)加酶量從6 U增大到8 U時，果膠脫除率增幅最大；當(dāng)加酶量大于8 U時，果膠脫除率緩慢增長；當(dāng)加酶量為10 U時，果膠脫除率達到93%；當(dāng)加酶量繼續(xù)增大到12 U時，山楂原液中果膠的脫除率達到100%。這一結(jié)果符合Henri的酶底物中間物復(fù)合物學(xué)說和酶促反應(yīng)動力學(xué)方程，即當(dāng)?shù)孜餄舛冗h遠高于酶的濃度時，由于酶的數(shù)量有限，所以果膠脫除率較低，隨著酶濃度的增加，越來越多的酶與底物結(jié)合，反應(yīng)體系先達到穩(wěn)態(tài)，即中間復(fù)合物的生成速率與分解速率相等，酶促反應(yīng)速率達到最大；隨著酶濃度的進一步增加，底物濃度低于酶濃度，反應(yīng)速率與底物濃度呈正比，其關(guān)系與一級反應(yīng)動力學(xué)相符[24]。倪文兵等[25]用果膠酶酶解紅棗漿，得到了類似的結(jié)果，當(dāng)果膠酶添加量低于0.02%時，紅棗漿出汁率隨著加酶量的上升而不斷提高，當(dāng)加酶量超過0.02%時，隨著加酶量的繼續(xù)增大，出汁率基本不變，此時原料中的果膠近乎完全分解[26]。

圖1 加酶量對果膠脫除率的影響

2.2.2 酶解時間對果膠脫除率的影響

從圖2可以看出，在0～30 min之內(nèi)，隨著時間的延長，果膠的脫除率呈現(xiàn)一個明顯的增高趨勢，并且其增大的速率呈現(xiàn)由大到小的變化，這符合酶催化作用高效性的特點。當(dāng)酶解時間為30 min時，果膠的脫除率達到80%以上。超過30 min之后，果膠脫除率的變化量逐漸減小，直到最后趨近于0，果膠的脫除率達到93.54%。閆子柱等[27]、汪建紅[28]、畢凱媛等[29]、馮軍偉等[30]分別用果膠酶脫除不同原料中的果膠，其酶解時間均在1～4 h之間，果膠脫除率能達到99%左右。

2.2.3 酶解溫度對果膠脫除率的影響

從圖3可以看出，隨著溫度的上升，果膠脫除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度達到40 ℃時，果膠的脫除率達到最高，為98.08%，隨著溫度的進一步上升，果膠脫除率反而下降，這是因為酶的活性受到溫度的影響，高溫或低溫均會影響酶的活性，只有在酶的最適溫度條件下，酶才會最大限度地發(fā)揮作用。單因素結(jié)果表明，40 ℃是Pectinex Yield MASH果膠酶的最適溫度，在此溫度下該果膠酶能最大限度地發(fā)揮作用。在果膠酶脫膠領(lǐng)域，眾多研究報道證明果膠酶的最適溫度在40～50 ℃之間，過低或過高的溫度都不能使果膠酶發(fā)揮其最大的作用[27-30]。

圖2 酶解時間對果膠脫除率的影響

圖3 酶解溫度對果膠脫除率的影響

2.3 單因素方程的擬合

為了確定脫膠的最優(yōu)條件，在Design-Expert 6.0.10分析軟件中設(shè)定果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度這三個因素的取值范圍，如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析方法取值范圍

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化脫膠工藝

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

以酶解時間、加酶量、酶解溫度為自變量，以果膠脫除率為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗分析及結(jié)果如表3所示。

2.4.2 模型方程的建立及顯著性檢驗

采用Design-Expert軟件對表2所得的果膠脫除率試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合（表4），得到加酶量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）為自變量對果膠脫除率的回歸方程：果膠脫除率=84.51+3.72A+1.76B+3.26C-0.61AB+2.72AC+0.34BC。通過表4得出，整體模型的p=0.000 2＜0.01，表明二次模型極顯著，失擬項p=0.078 8＞0.05，不顯著，表明此二項模型擬合有效，可以分析和預(yù)測各因素與響應(yīng)值的關(guān)系。各影響因素的主次順序為：A（加酶量）＞C（酶解溫度）＞B（酶解時間）。

表3 響應(yīng)面試驗分析及結(jié)果

表4 回歸模型的方差分析

2.4.3 三個因素的響應(yīng)面分析

等高線的形狀則反映了各因素之間的交互作用，等高線呈橢圓形說明因素之間有交互作用，并且橢圓形越密集，兩因素之間的交互作用越顯著[31-33]。

從表4可以看出，因素A，B，C均能顯著影響果膠脫除率，尤其是因素A和C的p值均小于0.01，影響作用極顯著。從圖4（a）和（c）可以看出，酶解時間與加酶量、酶解溫度之間等高線的形狀在試驗條件范圍內(nèi)近似為直線，結(jié)合表4可以看出pAB和pBC均大于0.05，說明因素B（時間）與因素A（加酶量）、因素C（酶解溫度）之間不存在顯著的交互作用。而酶解溫度和加酶量之間等高線的形狀為橢圓，有一定的密集度，并且pAC=0.011 5＜0.05，說明因素A（加酶量）和因素C（酶解溫度）之間存在顯著的交互作用。

圖4 各因素交互作用對果膠脫除率的影響

2.4.4 山楂原液果膠脫除最佳工藝參數(shù)的確定及驗證試驗

用Design-Expert 6.0.10軟件求回歸方程的極值點，得到果膠脫除的最佳工藝條件：加酶量11.68 U、酶解時間51.58 min、酶解溫度44.18 ℃，在此條件下的果膠脫除率理論預(yù)測值為90.18%。對最佳脫膠工藝條件進行驗證試驗，考慮到實際實驗操作，將最佳脫膠工藝條件調(diào)整為：加酶量12 U、酶解時間52 min、酶解溫度45 ℃，在此條件下實際測得果膠脫除率為90.58%，與調(diào)整之前的預(yù)測值接近。

3 討論與結(jié)論

大量的研究已經(jīng)證明，山楂中的黃酮、多酚、多糖和有機酸等物質(zhì)具有一定的降血糖和降血脂效果[5,34-36]，因此，研究山楂加工新技術(shù)，充分開發(fā)利用山楂資源，提高山楂的經(jīng)濟價值具有重要意義。

結(jié)果表明，具有半乳糖醛酸酶活性的果膠酶對于山楂果膠的水解效果最好，而半乳糖醛酸酶的作用主要是將原料中的果膠酸降解為半乳糖醛酸，說明成熟的山楂果實中果膠主要以果膠酸的形式存在。另外，通過對果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度三個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到山楂果膠最佳的脫除工藝，有效地解決了山楂原粉噴霧干燥過程中粘壁的問題，為山楂原粉及其他高附加值山楂制品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。