范海茹，李京，許斌，李淑英*，王鳳忠*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（北京 100193）；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450046）

我國是重要的大豆消費國，我國的大豆年消費量約1.1億 t，位居世界首位[1]。豆粕是提取豆油后得到的一種副產(chǎn)品，提油后經(jīng)低溫或閃蒸脫溶處理得到低溫豆粕，其蛋白質(zhì)變性程度較小，常用來加工大豆蛋白制品，但是生產(chǎn)時對設(shè)備要求較高，且產(chǎn)量較少；工業(yè)生產(chǎn)中主要以高溫豆粕為主，高溫豆粕經(jīng)高溫脫溶后而得，約占豆粕產(chǎn)量的95%[2]，由于其蛋白質(zhì)高度變性，大約85%的豆粕被用于動物飼養(yǎng)，在食品上應(yīng)用極少[3-4]。豆粕含有大豆中全部蛋白質(zhì)，且用途較廣，具有極高的開發(fā)價值和利用價值[5]。

目前蛋白質(zhì)改性方法主要有化學(xué)法[6]、物理法[7]及酶解法[8]。酶解法更安全高效，作用條件溫和，顯著改善豆粕品質(zhì)，破壞或消除豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子，且將豆粕中蛋白質(zhì)酶解為多肽和氨基酸，不僅提升生物效價，還賦予酶解產(chǎn)物更多生物活性[10]，工業(yè)上應(yīng)用較廣[9]。

豆粕酶解制備小分子肽的研究多在豆粕的復(fù)合酶解與生物活性肽制備等方面[11]，也有報道利用酶解豆粕制備呈味肽的研究，但多數(shù)成果僅停留在實驗室階段[12-13]。我國調(diào)味品市場中，含肽調(diào)味品發(fā)展迅速，需求量與日俱增。現(xiàn)已發(fā)展至第四代鮮味調(diào)味料，即營養(yǎng)型鮮味調(diào)味料，該類調(diào)味料因加入植物類蛋白酶水解產(chǎn)物等物質(zhì)，具有一定營養(yǎng)價值，可補充人體必需氨基酸、小分子肽和微量元素等[14]。目前針對肽研究還存在一定問題，包括肽來源種類較少，肽資源尚待進一步開發(fā)等[15]。豆粕中粗蛋白含量高，營養(yǎng)豐富均衡、氨基酸組成合理，是制備呈味肽的優(yōu)質(zhì)蛋白原料，因此豆粕蛋白的高值化利用具有潛在的研究價值[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫豆粕（市售）；堿性蛋白酶（200 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司）；中性蛋白酶（50 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司）；木瓜蛋白酶（100 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司）；胰蛋白酶（＞250 N.F.U/mg，北京索萊寶科技有限公司）；菠蘿蛋白酶（600 U/mg，北京索萊寶科技有限公司）；NaOH、HCl（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

METTLER TOLEDO Five Easy Plus型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FA2004型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；FW 100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；UDK 159型全自動凱氏定氮儀（意大利VELP）；RH-QA型恒溫?fù)u床（常州中誠儀器制造有限公司）；3K15型醫(yī)用離心機（SIGMA）；G136T型滅菌鍋（AUTOCLAVE）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

取適量高溫豆粕原料，用粉碎機粉碎后，過80目篩，備用。

1.2.2 酶解工藝

參考余敏[16]的方法略作修改：以高溫豆粕粉為原料，配制成8%豆粕懸濁液，于121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)豆粕懸濁液至蛋白酶最適pH，加入適量蛋白酶后放入搖床，振蕩，防止豆粕樣品產(chǎn)生聚沉，溫度保持蛋白酶最適酶解溫度，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)酶解體系使pH保持不變，酶解一定時間后，取出酶解液，沸水浴10 min滅酶。以8 000 r/min離心15 min，取上清液，即為豆粕酶解液，凍干后-20 ℃冷凍備用。

1.2.3 蛋白酶的篩選

選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶，分別酶解8%豆粕液。不同蛋白酶反應(yīng)條件不同，選用：木瓜蛋白酶酶解溫度50℃，加酶量25 000 U/g，pH 6.35；中性蛋白酶酶解溫度50 ℃，加酶量6 000 U/g，pH 6.35；堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，加酶量4 000 U/g，pH 9；菠蘿蛋白酶酶解溫度45 ℃，加酶量30 000 U/g，pH 6.35；胰蛋白酶酶解溫度37 ℃，加酶量31 250 U/g，pH 8。分別酶解12 h，以酶解產(chǎn)物的水解度和滋味稀釋因子為指標(biāo)，篩選出最佳內(nèi)切蛋白酶。

1.2.4 單因素試驗

配制8%豆粕懸濁液，最佳內(nèi)切酶為水解酶，以加酶量、水解時間、水解pH為單因素進行單因素試驗，測定水解度和滋味稀釋因子。

1.2.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正交試驗中各因素范圍，選擇L9(34)正交表，以水解度為指標(biāo)，對加酶量、水解時間、水解pH進行正交優(yōu)化，因素水平表見表1，試驗重復(fù)3次。

表1 中性蛋白酶正交試驗因素水平表

1.2.6 總蛋白含量測定

參考GB 5009.5—2016[17]對蛋白質(zhì)含量測定方法，取1 g高溫豆粕粉進行消化，使用全自動凱氏定氮儀測定總蛋白含量。

1.2.7 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測定

參考Liu等[18]和余敏[16]的方法，采用pH-Stat法，在高溫豆粕粉酶解過程中，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)酶解體系使pH保持不變，記錄消耗的NaOH溶液體積，以計算水解度。

式中：B表示酶解過程中消耗NaOH溶液的體積，mL；Nb表示NaOH溶液的濃度，mol/L；α表示氨基的解離度，α=10(pH-pK)/[1+10(pH-pK)]，試驗pK=7；Mp表示底物蛋白質(zhì)含量，g；htot表示每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，豆粕htot=8.38。

1.2.8 滋味稀釋分析（Taste dilution analysis，TD）

參考Liu等[18]和Seo等[19]的方法，采用比較滋味稀釋分析對高溫豆粕蛋白酶解產(chǎn)物進行苦味稀釋因子測定，每個樣品的TD值采用各個感官評價員評定結(jié)果的平均值，各個感官評價員評定結(jié)果之間的差異≤一個稀釋水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用Graphpad Prism 7軟件作圖，采用Design Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 高溫豆粕的蛋白質(zhì)含量

通過凱氏定氮法測定，高溫豆粕中的蛋白質(zhì)含量為40.41%。

2.2 蛋白酶的篩選

圖1 不同酶解時間下豆粕蛋白酶解產(chǎn)物的水解度和TD值的變化

如圖1所示，5種酶解產(chǎn)物水解度由高到低依次為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶。在酶解過程中，水解度逐漸升高，同時多肽及氨基酸大量產(chǎn)生。TD值也顯示出上升趨勢，說明多肽產(chǎn)生的苦味在苦味感官上起主要作用。堿性蛋白酶的苦味值遠(yuǎn)高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶水解度低于中性蛋白酶。因此，為得到低苦味且酶解效果好的產(chǎn)物，選擇中性蛋白酶進行后續(xù)試驗。

2.3 中性蛋白酶酶解高溫豆粕工藝條件

2.3.1 單因素試驗優(yōu)化中性蛋白酶最佳酶解條件

在溫度50 ℃、加酶量6 000 U/g、酶解時間3 h條件下，探究pH對水解度的影響。由圖2（A）可知，當(dāng)pH 5.5時得最大水解度，pH 6時水解度（24.86%）略低于pH 5.5，但無明顯差異，且為減少酶解過程中資源浪費，故選擇pH 5.8，6和6.2作為正交試驗中考察的pH參數(shù)水平。

在溫度50 ℃、加酶量6 000 U/g、pH 6.35的酶解條件下，測定不同時間的水解度和TD值。如圖2（B）所示，TD值在2 h后無變化，5 h后水解度（23.55%）逐漸穩(wěn)定。故選擇酶解時間4.5，5和5.5 h作為正交試驗的時間參數(shù)水平。

在溫度50 ℃、pH 6.35條件下酶解3 h，分別取樣品測水解度和TD值。由圖2（C）可知，隨加酶量逐漸增加，加酶量達3 000 U/g后，TD值不再升高，水解度也隨加酶量增加而逐漸平穩(wěn)。故選擇中性蛋白酶加酶量4 500，6 000和7 500 U/g為正交試驗中加酶量的參數(shù)水平。

圖2 單因素試驗優(yōu)化中性蛋白酶最佳酶解條件

2.3.2 正交試驗優(yōu)化中性蛋白酶最佳酶解條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以加酶量、pH和時間為因素，參考L9(34)正交試驗因素水平表設(shè)計三因素三水平正交優(yōu)化試驗（表1），以水解度為考察指標(biāo)，確定中性蛋白酶酶解高溫豆粕的工藝條件。由表2可知，三個指標(biāo)的影響順序為B＞A＞C；最優(yōu)酶解組合為A3B1C2，即加酶量7 500 U/g，pH 5.8，酶解時間5 h。對此組合可靠性進行驗證，按照此條件對高溫豆粕酶解，水解度為31.16%，高于表2中任何一組。

表2 中性蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果

3 討論

在相同的酶解條件下，不同蛋白酶對蛋白質(zhì)酶解效果不同，主要是酶具有專一性，每種酶只能作用于某些特定的位點，所以即使是同樣的底物，不同酶的水解效果會有所不同[20]。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶均屬于內(nèi)切酶，因為作用位點各異，對高溫豆粕的水解效果不一，產(chǎn)生的多肽氨基酸組成、游離氨基酸含量等不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的苦味值也不同。

酶解pH、酶解時間和蛋白酶添加量均會影響酶解產(chǎn)物的水解度。其中，pH對酶解反應(yīng)影響的原因有很多。劉淳等[21]研究表明，酶的活性與酶解環(huán)境的酸堿程度有關(guān)，過酸或過堿時，酶會發(fā)生可逆或不可逆失活，并且pH可改變底物及酶的結(jié)合狀態(tài)，影響二者作用效果，從而降低酶的活性。寧芯等[22]也有相似的結(jié)論，即調(diào)節(jié)pH會引起溶液中H+濃度的變化，可以影響蛋白酶自身的解離和底物的解離，從而影響酶與底物蛋白的結(jié)合與催化。李俊江等[23]研究也表示，pH影響酶的穩(wěn)定性，在調(diào)節(jié)pH的過程中，其對蛋白酶的空間構(gòu)象與催化相關(guān)基團的解離狀態(tài)、酶和底物的結(jié)合和解離會有不同程度的影響，從而影響酶解反應(yīng)。增加蛋白酶用量，可促進酶與底物之間的結(jié)合，但在酶解反應(yīng)中，酶用量并不是越多越好。當(dāng)?shù)孜餄舛炔蛔儠r，增加蛋白酶用量，酶量會由少至多，甚至過剩，則單位時間內(nèi)存在部分酶無法與底物結(jié)合，使水解效果增幅變緩[24]。另外，酶作為一種蛋白，極有可能在酶解過程中發(fā)生酶解反應(yīng)，用量過度會干擾酶解物構(gòu)成[25]。在酶解反應(yīng)過程中，水解度大都先快速增加，后增速變緩，可能是隨該反應(yīng)時間延長，蛋白酶活逐漸下降，導(dǎo)致酶解速率減緩；另外一個原因是豆粕中包含了可溶性蛋白和不溶性蛋白，可溶性蛋白中敏感性肽鍵會在早期階段與蛋白酶快速作用并斷裂，而不敏感肽鍵斷裂遲緩；不溶性蛋白的酶解過程中，酶分子吸附在其表面，首先酶切較稀疏的多肽鏈，然后再緩慢水解中心的肽鍵[26]。

4 結(jié)論

以高溫豆粕為原料，以水解度和滋味稀釋因子為指標(biāo)，比較了內(nèi)切酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶）的酶解效果，篩選出最佳內(nèi)切酶，為中性蛋白酶；并通過單因素試驗考察了中性蛋白酶添加量、酶解pH和酶解時間3個因素對豆粕蛋白水解度和苦味TD值的影響，在此基礎(chǔ)上，通過L9(34)正交試驗優(yōu)化了酶解高溫豆粕的酶解工藝，即中性蛋白酶添加量7 500 U/g、pH 5.8、酶解時間5 h。在此條件下水解度為31.16%。此次試驗為高溫豆粕高值化利用奠定理論基礎(chǔ)。