王鑫，韓茜宇*，薛宏坤

1. 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（大理 671003）；2. 黑龍江國際旅行衛(wèi)生保健中心（哈爾濱 150090）；3. 清華大學(xué)工程物理系，粒子與輻射成像教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100084）

“雙豐”山葡萄為葡萄科葡萄屬植物，具有顯著的抗寒、抗旱特點(diǎn)，被廣泛種植于中國東北地區(qū)，其果實(shí)柔軟多汁，風(fēng)味獨(dú)特，且含有豐富的天然活性成分，備受人們喜愛[1]?！半p豐”山葡萄主要用于制作果汁和果酒，在產(chǎn)品制作過程中，葡萄皮通過作為副產(chǎn)物（占整個(gè)葡萄的10%）被大量遺棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。葡萄皮中富含大量花色苷、多酚、維生素、超氧化物歧化酶等活性成分，可作為天然活性成分的重要來源。因此，如何將副產(chǎn)物變廢為寶已成為科研關(guān)注熱點(diǎn)。

花色苷是葡萄皮中重要的活性成分之一，其基本結(jié)構(gòu)單元為C6—C3—C6骨架構(gòu)成的2-苯基苯并吡喃[2]，結(jié)構(gòu)如圖1所示。因獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病和增強(qiáng)視力等功效[3]。如何高效地從“雙豐”山葡萄皮中提取花色苷，從而提高山葡萄的附加值，已成為科研人員亟待解決的問題?；ㄉ仗崛≈饕捎脗鹘y(tǒng)的浸提法，該方法存在效率低、耗時(shí)長、萃取溶劑消耗量大、后期易造成熱敏性物質(zhì)的降解等問題[4]，無法滿足對高效率和高得率花色苷的需求。超聲輔助提取法作為一種新型的植物活性成分提取技術(shù)，利用超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)加速細(xì)胞壁破裂，減小目標(biāo)成分的擴(kuò)散阻力，使細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)成分更容易從細(xì)胞中擴(kuò)散到周圍溶劑，從而有效提高目標(biāo)成分得率[5-6]。因此，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于黃酮[7]、多酚[8]、多糖[9]、油類[10]等的提取。而關(guān)于采用超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的研究鮮見報(bào)道。

圖1 花色苷的基本結(jié)構(gòu)[2]

鑒于此，采用超聲輔助提取技術(shù)對“雙豐”山葡萄皮花色苷進(jìn)行提取，探究超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度、料液比對花色苷得率的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝；在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對“雙豐”山葡萄皮花色苷組分進(jìn)行鑒定，以期提高“雙豐”山葡萄的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“雙豐”山葡萄（東北小興安嶺地區(qū)），成熟后于8月中旬采摘，除雜、清洗、晾干、去皮，果皮置于-20 ℃的冷凍干燥機(jī)凍至48 h，然后用植物粉碎機(jī)將其粉碎，過40目篩，制成“雙豐”山葡萄皮粉末，密封避光保存在-18 ℃冰箱中備用。

甲酸、乙腈、甲醇、乙醇（均為色譜純，美國Fisher公司）；矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，美國諾威公司）；醋酸纖維素膜（0.45 mm，天津市科密歐化學(xué)實(shí)劑有限公司）；AB-8大孔樹脂（日本三菱公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ600DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；220D電子分析天平（上海力辰儀器科技有限公司）；J-HH-6A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海勝衛(wèi)電子科技有限公司）；LAMBDA35型紫外分光光度計(jì)（美國Perkin Elmer公司）；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州紫拓儀器設(shè)備有限公司）；DRYER真空冷凍干燥器（德國西門子公司）；Agilent1260高效液相色譜-布魯克質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷

準(zhǔn)確稱取2.000 0±0.000 5 g經(jīng)1.1所制得的“雙豐”山葡萄皮粉末置于真空包裝袋中，按照不同料液比加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液[11]，使其充分混合，封口，將其放入超聲設(shè)備中進(jìn)行提取，同時(shí)固定不同提取溫度，提取結(jié)束后，將萃取液置于離心機(jī)中以5 000 r/min離心15 min，收集上清液，然后將所得的殘?jiān)貜?fù)上述操作提取2次，合并3次所得濾液，隨后用醋酸纖維素膜（0.45 mm）過濾，所得的濾液置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的單因素試驗(yàn)

稱取2.000 0±0.000 5 g“雙豐”山葡萄皮粉末樣品作為提取對象，選擇體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為提取溶劑，考察不同超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度和料液比對“雙豐”山葡萄皮粉末中花色苷含量的影響。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)定超聲功率100，200，300，400和500 W 5個(gè)水平；超聲時(shí)間20，25，30*，35和40 min 5個(gè)水平；提取溫度30，40，50*，60和70 ℃ 5個(gè)水平；料液比1∶10，1∶20，1∶30*，1∶40和1∶50（g/mL），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。（注：*表示當(dāng)考察其他參數(shù)對“雙豐”山葡萄皮粉末花色苷含量影響時(shí)，用*標(biāo)記的因素保持恒定水平。）

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。

表1 超聲輔助提取山葡萄皮粉末花色苷的L9(33)正交試驗(yàn)因素及水平

1.3.3 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定樣品中花色苷含量，參考于澤源等[12]的方法并略做改動。取1 mL樣品，分別加入9 mL pH 1.0氯化鉀緩沖液和9 mL pH 4.5乙酸鈉緩沖液，將其混合，避光靜置1 h，分別在520和700 nm處測定其吸光度，花色苷的含量表達(dá)式如式（1）所示。

式中：c為樣品中花色苷含量，mg/g；A為樣品提取液的吸光度；DF為稀釋倍數(shù)；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；Ma為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；L為比色皿光程，cm；V為總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 HPLC-ESI/MS法對“雙豐”山葡萄皮粉末花色苷組分鑒定

樣品準(zhǔn)備：在最佳工藝條件下獲得的“雙豐”山葡萄花色苷提取液，將其在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，準(zhǔn)確移取20 mL山葡萄皮花色苷濃縮液，并將其注入已活化的AB-8大孔樹脂柱（2.6 cm×60 cm）中充分吸附，進(jìn)樣流速1.5 mL/min，進(jìn)樣完全后，依次用酸化的去離子水（0.01% HCl）、30%乙醇溶液（0.01% HCl）和95%乙醇溶液（0.01% HCl）洗脫，洗脫流速1.0 mL/min，收集洗脫液，將其在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到山葡萄皮花色苷純化液，將其在冷凍干燥機(jī)中凍干成粉，將其用0.1% HCl-甲醇溶液稀釋后，配制成濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液，溶液過0.45 μm濾膜，用于HPLC分析。

色譜條件：Aglient 1260 C18柱（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流動相A為體積分?jǐn)?shù)5%甲酸水溶液，流動相B為乙腈-水-甲酸（體積比61.5∶37∶2.5）。洗脫程序：0～5 min，5%～20%流動相B，保持5 min；5～15 min，20%～25%流動相B，保持5 min；15～25 min，25%～30%流動相B，保持5 min；25～35 min，30%～5%流動相B，保持5 min；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量25 μL；檢測波長520 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（ESI），質(zhì)譜采用正離子掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m/z200～2 000，毛細(xì)管電壓4.5 kV，霧化器壓力1.5 bar，干燥溫度220 ℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用SPSS 16.0軟件對每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）；采用SAS 8.0軟件分析結(jié)果的顯著差異；Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對“雙豐”山葡萄皮花色苷含量的影響

超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖2（A）可知，超聲功率100～300 W時(shí)，隨超聲功率增加，花色苷得率呈顯著增加趨勢（p＜0.05），在300 W時(shí)，花色苷得率取得最大值（0.62±0.03 mg/g），其原因是隨超聲功率增加，機(jī)械震動效應(yīng)和空化效應(yīng)顯著增加，使得在萃取液中產(chǎn)生較大剪切力，引起山葡萄皮細(xì)胞壁破裂，傳質(zhì)阻力降低，擴(kuò)散系數(shù)增加，進(jìn)而促進(jìn)花色苷從山葡萄皮細(xì)胞中快速擴(kuò)散出來[13]。隨后繼續(xù)增加超聲功率，花色苷得率呈現(xiàn)顯著降低趨勢（p＜0.05）。這歸因于在過高的超聲功率下，高強(qiáng)度的空化效應(yīng)破壞花色苷結(jié)構(gòu)，同時(shí)也會引起非花色苷類雜質(zhì)的溶解，導(dǎo)致花色苷溶解度降低[14]，從而使得花色苷得率呈現(xiàn)顯著降低趨勢。故選擇超聲波功率為200，300和400 W作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。

由圖2（B）可知，超聲時(shí)間20～30 min時(shí)，花色苷得率隨超聲時(shí)間延長呈現(xiàn)顯著增加趨勢（p＜0.05），隨后繼續(xù)延長超聲時(shí)間，花色苷得率無顯著變化（p＞0.05）。其原因是在萃取初期，花色苷在細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度較大，有利于花色苷從細(xì)胞中擴(kuò)散到周圍溶劑中，使得花色苷得率顯著增加。進(jìn)一步延長超聲時(shí)間，可能由于萃取液中花色苷濃度與山葡萄皮細(xì)胞內(nèi)花色苷濃度一致，內(nèi)外濃度梯度趨近于零，即萃取液中花色苷達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，進(jìn)一步延長超聲時(shí)間，花色苷得率基本保持不變，故超聲時(shí)間設(shè)定為30 min，后續(xù)不再優(yōu)化超聲時(shí)間。

由圖2（C）可知，隨提取溫度增加，花色苷得率呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低趨勢（p＜0.05），提取溫度50 ℃時(shí)，花色苷得率取得最大值（0.68±0.01 mg/g）。其原因是隨提取溫度增加，萃取液黏度降低，擴(kuò)散系數(shù)和溶解度增加，使得花色苷更容易從細(xì)胞中被擴(kuò)散出來[15]，故花色苷得率增加。繼續(xù)增加提取溫度不利于花色苷提取，這是由于花色苷屬于熱敏性成分，高溫破壞花色苷與糖分子形成的糖苷鍵，引起花色苷呈指數(shù)形式降解[16]，從而使花色苷得率降低，故提取溫度選擇40，50和60 ℃作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。

由圖2（D）可知，料液比1∶10～1∶30（g/mL）時(shí)，花色苷得率隨料液比增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢（p＜0.05），其原因是隨萃取溶劑增加，細(xì)胞內(nèi)外花色苷濃度梯度增加，濃度梯度作為花色苷傳質(zhì)驅(qū)動力，較大的濃度梯度驅(qū)動有利于花色苷由內(nèi)向外擴(kuò)散，從而增加花色苷得率。料液比超過1∶30（g/mL）時(shí)，繼續(xù)增加料液比，花色苷得率則呈現(xiàn)顯著降低趨勢（p＜0.05）。歸因于過多溶劑會產(chǎn)生雜質(zhì)、色素等，降低花色苷的溶解度，從而不利于花色苷的提取[17]；另外溶劑過大，會對后續(xù)提取物的濃縮帶來很大的工作量。因此，綜合考慮，料液比選擇1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。

圖2 超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、提取溫度（C）和料液比（D）對山葡萄皮花色苷含量的影響

2.2 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的正交試驗(yàn)結(jié)果

超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。通過極差大小確定各因素對花色苷得率影響的主次順序：C＞A＞B。最優(yōu)水平組合為A2B3C3，即超聲功率300 W、提取溫度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）。對最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證，在最優(yōu)參數(shù)組合下山葡萄皮花色苷得率為0.71±0.03 mg/g，說明超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷工藝得到優(yōu)化。

表2 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 “雙豐”山葡萄皮花色苷組分鑒定

在最佳參數(shù)組合下所得花色苷粗提液，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后所得樣品，再經(jīng)HPLC-ESI/MS分析，其結(jié)果如圖3、圖4和表3所示。

由圖3可知，山葡萄皮粗提液經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后得到3種花色苷組分，結(jié)合各組分的色譜保留時(shí)間、分子離子峰和丟失的碎片來共同判斷3種花色苷組分的組成。圖3中1號峰的質(zhì)譜圖如圖4（A）所示，分子離子[M+]為465.0，碎片離子m/z303.1，其中m/z303是飛燕草素的特征離子，丟失的碎片m/z162，可能為葡萄糖和半乳糖，結(jié)合資料分析[18]，最終可判定1號峰為飛燕草素-3-葡萄糖苷。圖3中2號峰的質(zhì)譜圖如圖4（B）所示，分子離子[M+]為449.0，碎片離子m/z287.1，m/z287是矢車菊素的特征離子，丟失的碎片162，研究結(jié)果與Pertuzatti等[19]研究高叢藍(lán)莓花色苷中的矢車菊素-3-葡萄糖苷的質(zhì)譜信息相一致。因此，2號峰為矢車菊素-3-葡萄糖苷。圖3中3號峰的質(zhì)譜圖如圖4（C）所示，分子離子[M+]為625.2，碎片離子m/z463.1和m/z301.2，可能是由分子離子失去一分子己糖苷（Δm/z162）而成，m/z463.1和301.3之間也相差一個(gè)分子量162的己糖苷，且m/z301是芍藥素色素的特征離子，推測3號峰物質(zhì)可能是帶有兩個(gè)己糖苷的芍藥色素花色苷。該研究結(jié)果與Wang等[20]在相同高效液相色譜-質(zhì)譜檢測條件下鑒定出芍藥素-3, 5-二己糖苷的質(zhì)譜信息一致。因此，最終判定3號峰為芍藥素-3, 5-二己糖苷。

圖3 經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后所得山葡萄皮花色苷組分的液相色譜圖

圖4 花色苷組分質(zhì)譜圖

表3 山葡萄皮花色苷種類鑒定表

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化出超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的工藝：超聲功率300 W、超聲時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）。在此條件下花色苷得率為0.71±0.03 mg/g，經(jīng)HPLC-ESI/MS鑒定發(fā)現(xiàn)山葡萄皮中包含3種花色苷組分。試驗(yàn)結(jié)果有助于提高“雙豐”山葡萄的附加值，同時(shí)可為天然花色苷保健品的開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。