熊偉，付建平，韓曉丹，吳磊，李雄輝

江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所（南昌 330096）

原花青素是由兒茶素、表兒茶素及其沒(méi)食子酸酯通過(guò)C4—C6或C4—C8共價(jià)相聯(lián)組成的聚合體[1-2]，它能清除人體內(nèi)過(guò)剩自由基，提高人體免疫力，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無(wú)毒的新型抗氧化劑[3-7]。原花青素B2是由2個(gè)表兒茶素聚合而成的二聚體，有研究表明，它是原花青素中抗氧化活性最強(qiáng)的單體，可作為衡量原花青素質(zhì)量的標(biāo)志性成分[8-9]。由于原花青素B2在聚合體中含量較低，而且與其他聚合體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相近，這對(duì)其分離造成了極大的困難。因此，國(guó)內(nèi)外關(guān)于原花青素B2單體等相關(guān)成熟的制備分離工藝還極少。

分子印跡聚合物是將功能單體在模板分子存在條件下進(jìn)行交聯(lián)聚合，洗脫除去模板分子制得的聚合物，它在空間結(jié)構(gòu)和功能基排布上具有與目標(biāo)分子互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的空穴，對(duì)模板分子具有“記憶”功能，從而對(duì)目標(biāo)分子具有可預(yù)定的選擇性[10-11]。大部分分子印跡聚合物的制備過(guò)程均在弱極性溶劑中進(jìn)行[12]。從結(jié)構(gòu)上分析，原花青素B2含有多個(gè)羥基，其極性較大而不易溶于非極性或弱極性溶劑。試驗(yàn)在分子印跡聚合物的制備過(guò)程中引入金屬離子，利用金屬離子的配位作用，制備出具有較高選擇識(shí)別能力的配位分子印跡聚合物，在強(qiáng)極性溶液中選擇性吸附原花青素B2，從而擴(kuò)大分子印跡技術(shù)的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素B2對(duì)照品（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司）；2-乙烯基吡啶、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、偶氮二環(huán)己基甲腈（ACCN）、硝酸鋁、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鉀、氯化鈉、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇等（均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance E2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；KQ-100B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化科技有限公司）；JM-10002天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素B2-金屬配位分子印跡聚合物的制備

將模板分子原花青素B2、金屬離子、功能單體（2-乙烯基吡啶）加入溶劑中，超聲振蕩2 h，使金屬離子和原花青素B2充分配位。向溶液中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）和引發(fā)劑偶氮二環(huán)己基甲腈（ACCN），超聲振蕩20 min，充氮10 min后真空密封，60 ℃恒溫水浴熱引發(fā)聚合24 h，得到印跡聚合物。聚合物烘干后研磨粉碎過(guò)200目篩，于甲醇溶液中反復(fù)清洗除去過(guò)細(xì)顆粒。將得到的聚合物在索氏提取器中用乙酸/甲醇（體積比9∶1）的溶液抽提、洗脫模板分子原花青素B2，直至回流液中用高效液相色譜在280 nm處檢測(cè)不到為止；用4 mmol/L EDTA溶液洗滌除去殘留在聚合物中的金屬離子，最后用水和甲醇重復(fù)洗滌pH至中性，放入真空干燥箱中干燥，得到原花青素B2金屬配位分子印跡聚合物。以非配位印跡聚合物（不加金屬離子）和空白印跡聚合物（不加模板分子和金屬離子）為對(duì)照。以分子印跡聚合物對(duì)原花青素B2的吸附量為指標(biāo)，研究不同金屬離子配位、交聯(lián)劑用量、功能單體用量、溶劑種類等對(duì)吸附性能的影響。

1.3.2 原花青素B2-金屬離子配位印跡聚合物吸附量的測(cè)定

精確稱取0.1 g待測(cè)金屬配位印跡聚合物置于25 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL的原花青素B2甲醇溶液（濃度2～5 mg/mL），于37 ℃下恒溫振蕩吸附12 h，吸附平衡后離心取上清液，檢測(cè)其中原花青素B2濃度，并計(jì)算聚合物吸附量，計(jì)算如式（1）。

式中：Q為聚合物對(duì)原花青素B2吸附量，mg/g；C0為吸附前溶液中原花青素B2質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后溶液中原花青素B2質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；m為分子印跡聚合物質(zhì)量，g。

1.3.3 原花青素B2的檢測(cè)

采用RP-HPLC法檢測(cè)原花青素B2含量[13]，具體條件為：色譜柱，Hypersil ODS2；流動(dòng)相，甲醇-2%冰醋酸，梯度洗脫；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬離子種類對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

采用不同金屬離子與原花青素B2形成配位化合物，不同金屬離子對(duì)聚合物的吸附量影響見(jiàn)圖1。Al3+配位對(duì)原花青素B2的吸附效果最好，Zn2+、Cu2+次之，Na+、K+吸附效果較差。這可能是由于不同金屬離子與模板分子形成聚合物時(shí)的空間幾何構(gòu)型不同，從而導(dǎo)致印跡聚合物對(duì)原花青素B2的結(jié)合能力不同。

圖1 金屬離子對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

2.2 金屬離子用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

在確定Al3+為配位離子的情況下，研究Al3+用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著Al3+用量增加，吸附量呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)。這可能是由于一方面金屬離子增多，增加模板分子的配位機(jī)會(huì)，有利于吸附；而另一方面，其他雜質(zhì)也有可能參與配位，與模板分子形成競(jìng)爭(zhēng)。所以，Al3+與模板分子的摩爾比應(yīng)控制在3∶1左右。

圖2 金屬離子用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

2.3 溶劑種類對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

不同溶劑種類對(duì)印跡聚合物吸附量的影響見(jiàn)圖3。甲醇的吸附效果最好，而丙酮和正丁醇的吸附效果較差。這說(shuō)明選擇溶劑時(shí)，既要充分考慮溶劑對(duì)模板分子的溶解效果，從而不影響聚合過(guò)程，又要考慮溶劑極性大小對(duì)模板分子和功能單體結(jié)合的影響，所以溶劑選擇甲醇為宜。

圖3 溶劑種類對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

2.4 交聯(lián)劑用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

不同交聯(lián)劑用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響見(jiàn)圖4。隨著交聯(lián)劑用量增加，聚合物吸附量呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)。這是因?yàn)榻宦?lián)劑（EGDMA）用量較小時(shí)，其結(jié)構(gòu)松散，比表面積較大，聚合物的有效結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目減少，從而降低聚合物的選擇識(shí)別能力和吸附容量；但是交聯(lián)劑用量過(guò)大時(shí)，會(huì)使聚合度過(guò)高，模板分子原花青素B2不易洗脫，吸附位點(diǎn)被占據(jù)，從而使吸附量下降。所以，交聯(lián)劑與模板分子的摩爾比取40∶1為宜。

圖4 交聯(lián)劑用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

2.5 功能單體用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

不同功能單體用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響見(jiàn)圖5。隨著功能單體用量增加，印跡聚合物的吸附量呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)。這是由于功能單體用量過(guò)少時(shí)，2-乙烯基吡啶與原花青素B2形成的結(jié)合位點(diǎn)少而且不穩(wěn)定，但功能單體用量過(guò)大時(shí)，可能會(huì)引起自身的聚合，從而降低了具有選擇識(shí)別性的穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，并最終影響吸附效果。所以，功能單體2-乙烯基吡啶與模板分子原花青素B2的摩爾比取8∶1為宜。

圖5 功能單體用量對(duì)印跡聚合物吸附量的影響

2.6 不同印跡聚合物吸附性能的比較

考察在最優(yōu)條件下制備的離子配位印跡聚合物、非配位印跡聚合物和空白印跡聚合物的吸附性能，結(jié)果見(jiàn)表1。3種聚合物中離子配位印跡聚合物的吸附量最高，是非配位印跡聚合物吸附容量的1.98倍，空白印跡聚合物的14.8倍，說(shuō)明金屬離子的配位作用能顯著提高聚合物對(duì)原花青素B2的吸附量。

表1 不同印跡聚合物性能的比較

3 結(jié)論

以原花青B2為模板分子，結(jié)合Al3+的配位作用，2-乙烯基吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，偶氮二環(huán)己基甲腈（ACCN）為引發(fā)劑，甲醇為溶劑制備了原花青素-Al(Ⅲ)配位分子印跡聚合物。結(jié)果表明，n[模板分子（原花青素B2）]∶n[金屬配位化合物（Al3+）]∶n[功能單體（2-乙烯基吡啶）]∶n[交聯(lián)劑（EGDMA）]=1∶3∶8∶40時(shí)，制備的聚合物吸附效果最好。

利用Al3+配位作用在強(qiáng)極性溶液中制備原花青素B2-Al(Ⅲ)配位分子印跡聚合物，在吸附過(guò)程中顯示出良好的吸附性與選擇性，能顯著提高對(duì)模板分子的吸附性能，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用和發(fā)展前景，并有望在其他活性成分的分離純化中推廣應(yīng)用。