黃東泉 鄭文霞 謝惠芳 彭永正，3

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，2神經(jīng)內(nèi)科，3輸血科（廣州510282）

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種α 突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-Syn）異常沉積于大腦神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病，其特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變形、丟失，在65 歲以上人群中的發(fā)病率＞1%［1］。由于在PD 患者的腸道神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)了α-Syn 聚集體，因此一些研究人員推測(cè)α-Syn 聚集體首先出現(xiàn)在腸道神經(jīng)系統(tǒng)，然后從腸道神經(jīng)元轉(zhuǎn)移到大腦神經(jīng)元［2］。PD 患者中存在胃腸道功能障礙已經(jīng)得到公認(rèn)，并且被認(rèn)為是發(fā)生在出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)癥狀之前［3］。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在PD 的發(fā)病機(jī)制中的作用已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注，部分研究證實(shí)了PD 的表型與腸道菌群相關(guān)［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者腸道中嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）的豐度增加［5］，這與過往的“Akk 具有修復(fù)腸黏膜屏障，降低系統(tǒng)性炎癥的作用［6］”結(jié)論不相符。這也許是同種細(xì)菌的不同菌株對(duì)同一宿主發(fā)揮著完全不同的作用所致［7］。雖然筆者前期的工作表明Akk 在PD 組和對(duì)照組中差異沒有顯著性意義［8］，但PD 患者腸道各亞型Akk 的豐度情況尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。目前對(duì)于PD 的臨床診斷主要依靠患者表現(xiàn)出的運(yùn)動(dòng)癥狀，包括肢體僵硬，姿勢(shì)不穩(wěn)，震顫，動(dòng)作遲緩，乃至神經(jīng)精神癥狀［9］，暫無可靠的客觀指標(biāo)?；谏鲜鲈?，本研究將探討Akk 各亞型的豐度變化與PD 的關(guān)系，進(jìn)一步分析Akk 各亞型的豐度變化與血清尿酸（UA），甘油三酯（TG），總膽固醇（TC）和空腹血糖（Glu）等生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)情況，旨在為PD 的早期診斷提供新型生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)菌DNA 提取試劑盒，糞便DNA 提取試劑盒購(gòu)自美基生物（Magen，廣州美基生物科技有限公司）；RT-qPCR 試劑盒（TB GreenTM Premix ExTaqTM II）購(gòu)自日本TaKaRa 公司；AkkⅠ，AkkⅡ，Akk Ⅲ特異性引物和內(nèi)參16S rRNA 引物由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence list

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象收集2018年7月至2019年4月在我院就診的PD 患者40 例，PD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)2015年MDS 版的帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的18～85 歲原發(fā)性PD 患者；（2）近3 個(gè)月內(nèi)無抗生素或益生菌、益生元使用史。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：18～85 歲的南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院門診及健康體檢中心的體檢者。PD 組和對(duì)照組一般信息見表2。所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書，本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批同意。

表2 PD 組和對(duì)照組一般信息Tab.2 General information of PD and control group

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定收集空腹靜脈血于真空采血管（廣州陽普公司）中，室溫靜置30 min 后，3 000 g 離心10 min 分離血清。用羅氏Modular P800 分析儀（瑞士羅氏）及其配套試劑檢測(cè)血清中UA、TG、TC 和Glu 水平。

1.2.3 糞便DNA 的提取轉(zhuǎn)移100 mg 糞便樣品至2 mL 離心管中，立即加入1.2 mL Buffer SSL 至樣品中，最高渦旋1 min 充分打散樣品。70 ℃水浴10 min。渦旋15 s。室溫下，14 000 g 離心10 min。轉(zhuǎn)移250 μL 上清液至新的1.5 mL 離心管中。加入20 μL Proteinase K 和250 μL Buffer AL 上清液中。顛倒混勻10 次。70 ℃水浴10 min。加入250 μL 無水乙醇至樣品中，顛倒混勻10 次。把Hipure DNA Mini ColumnⅠ裝在2 mL 收集管中。轉(zhuǎn)移混合液至柱子中。10 000 g 離心30 s。倒棄流出液，加入500 μL Buffer GW1 和GW2，重復(fù)3次。13 000 g 離心2 min 甩干柱子。加入60 μL 預(yù)熱至70 ℃的Buffer AE 至柱子的膜中央，室溫放置2 min。13 000 g 離心1 min。丟棄DNA 結(jié)合柱，將DNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單菌DNA 的提取轉(zhuǎn)移0.5 mL 細(xì)菌培養(yǎng)液至1.5 mL 離心管中。10 000 g 離心1 min 收集細(xì)菌，倒棄培養(yǎng)液。加入200 μL Buffer STE 和10 μL Lysozyme 至細(xì)菌沉淀團(tuán)中。渦旋充分重懸細(xì)菌，37 ℃水浴10 min。加入220 μL Buffer DL 和10 μL ProteinaseK 至細(xì)菌重懸液中。渦旋混勻，65 ℃水浴消化30 min。加入5 μL RNase Solution 至細(xì)菌裂解液中?；靹?，室溫靜置20 min。加入220 μL無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30 s。把Hi-Pure gDNA Micro Column 裝在2 mL 收集管中。把第五步獲得的混合液轉(zhuǎn)移至柱子中。10 000 g 離心1 min。倒棄流出液，把柱子裝回收集管中。加入500 μL Buffer GW1 至柱子上。10 000 g 離心1 min。倒棄濾液，把柱子裝回收集管中。加入650 μL Buffer GW2 至柱子中。10 000 g 離心1 min。倒棄濾液，把柱子裝回收集管中。再加入650 μL Buffer GW2至柱子中。10 000 g離心1 min。倒棄流出液，把柱子裝回收集管中。10 000 g 離心2 min。將柱子裝在新的1.5 mL離心管中。加入40 μL 預(yù)熱至65 ℃的Buffer TE 至柱子膜中央。放置3 min。10 000 g 離心1 min。丟棄DNA 結(jié)合柱，將DNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）用于檢測(cè)糞便中AkkⅠ、AkkⅡ和Akk Ⅲ的相對(duì)豐度。先用NanoDrop ND2000c 分光光度計(jì)（Thermofisher 公司）測(cè)定DNA 的濃度和純度，再用Roche LightCycler480 PCR 儀檢測(cè)糞便中AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的相對(duì)豐度。反應(yīng)體系為：Mix 10.0 μL，正向和反向引物各0.8 μL，糞便DNA 2.0 μL，DEPC 水6.4 μL，共20.0 μL。PCR 擴(kuò)增的條件為：第一階段Denature 為95 ℃30 s，1 個(gè)循環(huán)；第二階段PCR 為95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；第三階段Melting為95 ℃5 s，60 ℃1 min，1 個(gè)循環(huán)；第四階段Cooling 為40 ℃30 s，1 個(gè)循環(huán)。每份樣品重復(fù)3 次。各亞型的相對(duì)豐度量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示。兩組間比較分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)；連續(xù)變量相關(guān)性分析用pearson 相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AkkⅠ、AkkⅡ和Akk Ⅲ的引物特異性驗(yàn)證提取三個(gè)亞型Akk 的DNA，進(jìn)行濃度梯度稀釋，并進(jìn)行RT-qPCR。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三個(gè)亞型Akk引物具有特異性（圖1）。

圖1 AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ引物的特異性Fig.1 Specificity of AkkI and AkkⅡ，AkkⅢprimers

2.2 PD 患者腸道Akk 各亞型豐度的變化在PD組和對(duì)照組的腸道中，均表現(xiàn)為AkkⅠ的豐度最高，AkkⅢ的豐度最低（圖2A）。不同的是，PD 組中AkkⅠ的豐度明顯高于AkkⅡ（P＜0.05），而對(duì)照組中AkkⅠ和AkkⅡ的豐度沒有明顯差異（P＞0.05，圖2A）。隨后對(duì)比PD 患者和對(duì)照組各亞型的Akk 豐度的差異，發(fā)現(xiàn)PD 患者腸道AkkⅠ和AkkⅡ的豐度減少，Akk Ⅲ的豐度出現(xiàn)增加（圖2B、C、D）。分析其在不同年齡層的差異，發(fā)現(xiàn)在65 歲及其以上的PD 患者腸道中AkkⅡ的豐度明顯減少（P＜0.05，圖2F），AkkⅠ和Akk Ⅲ的豐度未出現(xiàn)明顯的變化（P＞0.05，圖2E、G）。

2.3 PD 組和對(duì)照組的血清尿酸、血脂和血糖水平比較PD 組血清尿酸，總膽固醇水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05，圖3A、B），甘油三酯和空腹血糖與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3C、D）。血清尿酸，總膽固醇的異常值（男：UA＞420 μmol/L，女：UA＞360 μmol/L，TC＞6.00 mmol/L）剔除后，發(fā)現(xiàn)PD 組血清尿酸水平依然明顯低于對(duì)照組（P＜0.05，圖3E），而總膽固醇水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3F）。

2.4 血清尿酸水平和Akk 各亞型豐度的關(guān)系為了探討各亞型Akk 的豐度是否會(huì)影響血清尿酸的水平，將各亞型Akk 的豐度從低到高排序，取前20 例作為Akk 低豐度組，后20 例作為Akk 高豐度組。在PD 組中，AkkⅠ高豐度組的血清尿酸水平明顯增加（P＜0.05，圖4A）；在對(duì)照組中，兩組血清尿酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4A）。AkkⅡ和Akk Ⅲ的豐度的高低對(duì)血清尿酸的水平?jīng)]有影響（P＞0.05，圖4B、C）。

圖2 PD 患者腸道Akk 各亞型豐度的變化Fig.2 Abunance changes each subtype of Akk in PD patients

圖3 PD 組和對(duì)照組的血清尿酸、血脂和血糖水平比較Fig.3 Comparison of serum uric acid，total cholesterol，triglyceride and glucose levels between PD group and control group

圖4 血清尿酸水平和各亞型Akk 的豐度的關(guān)系Fig.4 Relationship between serum uric acid level and abundance of each Akk subtype

2.5 腸道AkkⅠ的豐度和血清尿酸水平對(duì)PD 患者病程和臨床表型的影響鑒于PD 患者血清尿酸水平明顯降低，且在PD 組中腸道AkkⅠ高豐度組的血清尿酸水平明顯增加，進(jìn)一步分析腸道AkkⅠ的豐度、血清尿酸水平對(duì)PD 患者病程和臨床表型的影響，發(fā)現(xiàn)在PD 組中，腸道AkkⅠ的豐度和血清尿酸水平呈正相關(guān)（P＜0.05，圖5A）。PD患者病程和腸道AkkⅠ的豐度及血清尿酸水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，圖5B、C），即腸道AkkⅠ的豐度和血清尿酸水平隨PD 患者病程的延長(zhǎng)而降低。在PD 組中，將患者血清尿酸水平從低到高排序，取前20 例作為低水平血尿酸組，后20 例作為高水平血尿酸組，探討腸道AkkⅠ的豐度和血清尿酸水平對(duì)PD 臨床表型的影響，發(fā)現(xiàn)AkkⅠ的豐度、血清尿酸水平與PD 患者出現(xiàn)震顫型或者強(qiáng)直型的表型沒有相關(guān)性（P＜0.05），見表3。

圖5 腸道AkkⅠ的豐度和血清尿酸水平對(duì)PD 患者病程的影響Fig.5 Effects of intestinal Akk Ⅰabundance and serum uric acid level on the course of PD patients

表3 AkkⅠ的豐度和血清尿酸水平對(duì)PD 臨床表型的影響Tab.3 Effects of AkkⅠabundance and serum uric acid levelon clinical genotypes of PD

3 討論

本研究率先分離了37 株人腸道Akk，通過測(cè)序?qū)⑵浞譃棰瘛笕齻€(gè)亞型，通過PCA 和CAZy 譜分析發(fā)現(xiàn)，AkkⅠ、AkkⅡ和Akk Ⅲ的基因組，以及對(duì)碳水化合物的代謝存在差異［10］，還找到了三個(gè)亞型的Akk 的特異性序列，為探討PD 與各亞型的Akk 的豐度變化的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

自發(fā)現(xiàn)Akk 以來，許多研究結(jié)果都表明Akk 具有修復(fù)腸黏膜屏障，降低系統(tǒng)性炎癥的作用，并且在多種代謝紊亂的疾病中其豐度明顯降低，包括肥胖癥、血脂異常和2 型糖尿病［6］。本研究還對(duì)各亞型Akk 的功能及其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。本研究結(jié)果表明AkkⅠ亞型（GP01 株）能有效降低系統(tǒng)性炎癥，改善糖耐量，緩解高脂飲食帶來的代謝紊亂，并抑制小鼠神經(jīng)退行性病變過程［11］。筆者自主分離的AkkGP01 株分解培養(yǎng)基成分產(chǎn)生乙酸、丙酸和異戊酸等短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的能力強(qiáng)于Akk 模式菌株（ATCC BAA-835，AkkⅠ），而低水平的SCFA 對(duì)腦神經(jīng)元能造成負(fù)面影響［11］。SUN 等［12］證明了特定的糞便菌群移植通過TLR4/TNF-α 通路對(duì)PD 模型小鼠的神經(jīng)元起到保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在健康體檢者和PD 患者腸道內(nèi)Akk三個(gè)亞型的相對(duì)豐度分布大致相同，AkkⅠ亞型的豐度均為最高，這似乎表明AkkⅠ是Akk在腸道中行使菌群功能的主力軍。雖然本研究沒有發(fā)現(xiàn)各亞型的Akk的豐度在PD患者腸道中出現(xiàn)明顯的變化，但發(fā)現(xiàn)在65歲及其以上PD患者腸道AkkⅡ的豐度出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05）。鑒于PD在65歲以上的老人中病發(fā)率較高［1］，未來將擴(kuò)大65歲以上的老人的樣本量來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，重點(diǎn)關(guān)注AkkⅡ的作用機(jī)制，進(jìn)一步探討Akk各亞型與PD之間潛在的關(guān)系。

盡管PD 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但氧化應(yīng)激一直是PD 發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)［13］。越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激可能損傷神經(jīng)元，而血清尿酸水平與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［13］。血清尿酸是體內(nèi)天然的抗氧化劑，具有清除自由基和抗氧化的作用［14］。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，較高水平的血清尿酸有助于降低PD的發(fā)病率［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)PD組血清尿酸水平明顯低于對(duì)照組，并且在PD組中AkkⅠ豐度的高低與血清尿酸水平呈正相關(guān)，AkkⅠ的豐度增高可以提高PD 患者血清尿酸的水平。AkkⅡ和Akk Ⅲ的豐度的高低與血清尿酸水平似乎沒有相關(guān)性。LU等［16］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胃旁路及袖狀胃切除術(shù)后，測(cè)序結(jié)果表明大鼠腸道Akk 的豐度增加，并且同時(shí)伴隨血清尿酸水平明顯下降，這也表明了Akk 的豐度可能會(huì)影響血清尿酸的水平。血清尿酸水平還與PD 患者的病情有關(guān)，早期和中期PD 患者的血清尿酸水平明顯高于晚期患者；預(yù)后良好PD 患者血清尿酸水平明顯高于預(yù)后差的患者［17］。莊順芝等［18］發(fā)現(xiàn)病程＞3年的PD 患者血清尿酸水平明顯低于病程＞3年的PD 患者。有試驗(yàn)證明長(zhǎng)期口服尿酸鹽的前體——肌苷可以增加血清尿酸水平，并且可能以劑量依賴的方式改善PD 患者的病情［19］。本研究發(fā)現(xiàn)血清尿酸水平隨著PD 患者病程的延長(zhǎng)而減少（圖5B），另外還發(fā)現(xiàn)AkkⅠ同樣隨著PD 患者病程的延長(zhǎng)而減少（圖5C），其中的機(jī)制可能是PD 患者腸道中AkkⅠ的豐度出現(xiàn)進(jìn)行性減少，導(dǎo)致血清尿酸的水平減少，氧化應(yīng)激增加，損傷的神經(jīng)元增加。這種推測(cè)基于筆者前期研究證實(shí)了AkkⅠ抑制小鼠神經(jīng)退行性病變［11］。PD 患者的腸黏膜屏障受損、微生物易位標(biāo)記增強(qiáng)、細(xì)菌內(nèi)毒素特異性配體TLR4，CD3+T 細(xì)胞表達(dá)增加，同時(shí)結(jié)腸活檢樣本呈現(xiàn)出較高的促炎基因譜［20］。未來將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討AkkⅠ的豐度與PD 的關(guān)系。目前對(duì)PD 的診斷主要取決于臨床表現(xiàn)而缺乏客觀的指標(biāo)，這不利于早期診斷。血清UA 水平和PD 有密切聯(lián)系，但其本身不足以作為PD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［21］。

綜上所述，本研究首次利用RT-qPCR 方法快速分析腸道內(nèi)Akk 三個(gè)亞型分布，發(fā)現(xiàn)在PD 組中，患者腸道AkkⅠ的豐度與血清尿酸水平呈正相關(guān)。PD 患者的病程與AkkⅠ的豐度、血清尿酸水平呈負(fù)相關(guān)；腸道低AkkⅠ豐度和低血清尿酸水平可能作為聯(lián)合指標(biāo)，為PD 的早期診斷提供新型生物標(biāo)志物。腸道AkkⅠ豐度及其代謝產(chǎn)物與PD、血清尿酸水平的關(guān)系，以及AkkⅡ豐度與PD 的關(guān)系都有待進(jìn)行深入研究。