周斌 謝福源 蘇學(xué)英 左新華

1鷹潭市人民醫(yī)院細(xì)胞學(xué)室（江西鷹潭335000）；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科（南昌330006）；3四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科（成都6100410）；4鷹潭市中醫(yī)院檢驗(yàn)科（江西鷹潭335000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，隨宮頸細(xì)胞學(xué)涂片普查的推廣，宮頸癌發(fā)病率有所降低，但呈現(xiàn)年輕化發(fā)展趨勢(shì)［1］。統(tǒng)計(jì)報(bào)道，全球范圍內(nèi)每年宮頸癌新發(fā)病例逾47 萬，我國(guó)宮頸癌新發(fā)病例約有13.5 萬，且宮頸癌仍為威脅女性生殖健康的主要惡性腫瘤之一［2］。已有大量研究數(shù)據(jù)證實(shí)，人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的始動(dòng)因素。HPV 的DNA 整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA 組在HPV 誘導(dǎo)宮頸癌變中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。一般HPV 感染多通過性途徑傳播，大多數(shù)無明顯癥狀［4］。全球約有3 億攜帶HPV 感染無癥狀女性，大多數(shù)女性感染HPV 后可在8～10 個(gè)月內(nèi)自行消失，但仍有5%～10%的女性機(jī)體無法自動(dòng)清除HPV，呈HPV 持續(xù)感染，可能出現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），經(jīng)過數(shù)十年最終進(jìn)展為宮頸癌。但近年來有學(xué)者指出，宮頸癌發(fā)病并非由單一HPV感染參與，生殖道病原微生物感染同樣可能參與宮頸癌發(fā)病過程，尤其感染病原菌種類增加可能增加宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［5-6］。人類皰疹病毒（epsteinbarr virus，EBV）屬皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒成員，與兒童淋巴瘤、鼻咽癌發(fā)病密切關(guān)聯(lián)，被認(rèn)為是可能致癌人類腫瘤病毒之一［7-8］。對(duì)EBV 感染與宮頸癌發(fā)病的關(guān)系尚存在爭(zhēng)論。研究統(tǒng)計(jì)，約有60%的宮頸癌患者癌組織存在EBV 感染［9］。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，CIN 患者EBER1 mRNA 檢出率高達(dá)83%，宮頸癌組織檢出率約為75%［10］。但對(duì)HPV、EBV 重疊感染在CIN 及宮頸癌發(fā)病中的意義及價(jià)值鮮少見報(bào)道。本研究擬選取課題組所在醫(yī)院留存歸檔的CIN 組織標(biāo)本92 份、宮頸癌組織標(biāo)本49 份、正常宮頸組織標(biāo)本30 份，以免疫組化法測(cè)定HPV、EBV 蛋白表達(dá)，旨在探討EBV、HPV 在宮頸癌發(fā)病中的作用，以期為宮頸癌防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取課題組所在醫(yī)院2017年1月至2019年1月收治且留存組織標(biāo)本的CIN 92 例及宮頸鱗癌49 例作為研究對(duì)象。所有對(duì)象年齡30～59 歲；術(shù)前均未接受放化療或其他抗腫瘤治療；未合并其他惡性腫瘤；臨床分期按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟大會(huì)通過［11］相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；組織學(xué)分級(jí)參照《外科病理學(xué)》［12］；組織標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師復(fù)查確診。其中CINⅠ級(jí)38 例，CINⅡ～Ⅲ級(jí)54 例，宮頸癌49例。CINⅠ級(jí)患者年齡30～59 歲，平均（42.6±10.7）歲；CINⅡ～Ⅲ級(jí)年齡30～58 歲，平均（42.5±10.3）歲；宮頸癌患者年齡32～58 歲，平均（43.5±11.3）歲。對(duì)照組取自同期因子宮良性疾病切除子宮但光鏡下宮頸上皮無異常病變的30 例患者，年齡30～58 歲，平均（41.9±10.5）歲。

1.2 主要試劑與儀器HPV 鼠抗單克隆抗體、EBV 鼠抗單克隆抗體、辣根標(biāo)記抗小鼠IgG 多聚體、即用型免疫組化通用試劑盒、胰蛋白酶、DAB顯色劑（均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司）；株海黑馬Win1412 臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Leica RM2235型切片機(jī)，亞光YT-6C 型烤片機(jī)，Olympus CX-31 型顯微鏡、數(shù)碼攝像系統(tǒng)。

1.3 方法免疫組化染色：各組織標(biāo)本3～4 μm連續(xù)切片，作HPV、EBV 免疫組化染色，預(yù)實(shí)驗(yàn)已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）替代一抗作為陰性對(duì)照。切片60 ℃烘烤1 h，脫蠟至水，3%過氧化氫封閉消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 洗滌3 次×3 min，熱抗原修復(fù)，PBS 洗滌3 次×3 min，加入正常山羊血清封閉內(nèi)源性生物素，加入稀釋HPV 鼠抗單克隆抗體（1∶50）、EBV 鼠抗單克隆抗體（1∶50），4 ℃冰箱內(nèi)過夜，PBS 洗滌3 次×3 min，加入生物素標(biāo)記羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育40 min，PBS 洗滌3 次×3 min，加入過氧化物酶標(biāo)記鏈霉菌抗生物素蛋白，37 ℃孵育0.5 h，PBS 洗滌3 次×3 min，DAB 溶液顯色5～15 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察，HPV 蛋白陽(yáng)性染色定位于宮頸鱗狀上皮細(xì)胞核，呈棕黃色；EBV 蛋白陽(yáng)性表達(dá)于EBV 感染細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少部分見于淋巴細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色。每切片至少取5 個(gè)高倍視野，累及計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞以上，EBV 或HPV 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過10%視為陽(yáng)性［13-14］。兩者均陽(yáng)性視為HPV、EBV重疊感染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正常宮頸組織、CIN、宮頸癌HPV、EBV 陽(yáng)性率比較采用等級(jí)秩和檢驗(yàn)與χ2或Fisher 檢驗(yàn)，組間兩兩比較應(yīng)用χ2分割檢驗(yàn)，變量相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，HPV、EBV 感染與宮頸癌發(fā)生是否存在協(xié)同作用采用析因分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HPV 蛋白、EBV 蛋白免疫組化結(jié)果整體比較：隨宮頸上皮內(nèi)瘤變的進(jìn)展，HPV 陽(yáng)性率、EBV 陽(yáng)性率、HPV+EBV 陽(yáng)性率上升，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HPV 陽(yáng)性、EBV 陽(yáng)性率、HPV+EBV 陽(yáng)性率均與宮頸上皮內(nèi)病變等級(jí)呈正相關(guān)（r=0.717、0.619、0.604，P＜0.001），見表1和圖1～2。分割比較：正常宮頸組織HPV 陽(yáng)性率、EBV 陽(yáng)性率、HPV+EBV 陽(yáng)性率低于CINⅡ～Ⅲ級(jí)、宮頸癌組織（P＜0.05），CINⅠ級(jí)HPV 陽(yáng)性率、EBV陽(yáng)性率、HPV+EBV 陽(yáng)性率低于CINⅡ～Ⅲ級(jí)、宮頸癌組織（P＜0.05），CINⅡ～Ⅲ級(jí)HPV 陽(yáng)性率、EBV陽(yáng)性率、HPV+EBV 陽(yáng)性率又低于宮頸癌組織（P＜0.05），見表2。

2.2 HPV 感染、EBV 感染、HPV+EBV 感染與宮頸癌發(fā)病的協(xié)同關(guān)系分析以宮頸癌發(fā)病為因變量，納入HPV 感染、EBV 感染及其重疊感染進(jìn)行析因分析，結(jié)果證實(shí)HPV+EBV 重疊感染對(duì)宮頸癌發(fā)病存在協(xié)同影響（F=5.687，P=0.018），方差分析兩者交互作用明顯，HPV+EBV 重疊感染對(duì)宮頸癌發(fā)病影響明顯，見表3。

表1 各組HPV 蛋白、EBV 蛋白免疫組化結(jié)果Tab.1 Immunohistochemical results of HPV protein and EBV protein in each group 例（%）

表2 各組HPV、EBV 蛋白陽(yáng)性率免疫組化結(jié)果（兩兩分割比較結(jié)果）Tab.2 Immunohistochemical results of HPV protein and EBV protein positive rates in each group（segmentation comparison results between any two）

圖1 各組組織HPV 蛋白免疫組化結(jié)果（IHC×200）Fig.1 Immunohistochemical results of HPV protein in tissues of each group（IHC×200）

圖2 各組組織EBV 蛋白免疫組化結(jié)果（IHC×200）Fig.2 Immunohistochemical results of EBV protein in tissues of each group（IHC×200）

3 討論

宮頸從正常上皮轉(zhuǎn)化為癌變歷經(jīng)復(fù)雜的病理過程，CIN 已被證實(shí)為宮頸癌癌前病變［15］。目前已證實(shí)高危型HPV 感染系引起CIN 及宮頸癌的重要原因［16］。HPV 系寄生于鱗狀上皮層小分子的雙鏈閉合環(huán)狀DNA 腫瘤病毒類型，屬乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤屬，含E1、E2、E4、E6、E7 等早期表達(dá)基因，其中E1 與HPV DNA 復(fù)制有關(guān)，E2 參與病毒DNA 轉(zhuǎn)錄反式激活，E4 則與細(xì)胞結(jié)合有關(guān)，E6、E7 則與病毒致癌性及細(xì)胞功能轉(zhuǎn)化有關(guān)，系HPV關(guān)鍵致癌蛋白類型［17］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HPV 編碼蛋白E6、E7 可維持小鼠上皮細(xì)胞永生化［18］。E6蛋白可特異性與腫瘤抑制蛋白p53 結(jié)合促使其降解，影響細(xì)胞周期調(diào)控；同時(shí)可激活端粒酶，導(dǎo)致細(xì)胞逃避衰老過程增殖制約，促使癌細(xì)胞永生化；此外，E6 蛋白可與干擾素調(diào)因子結(jié)合，促使其逃逸機(jī)體免疫反應(yīng)；且可粘附于腫瘤壞死因子表面，提升其活性，抑制細(xì)胞凋亡［19］。而E7 蛋白則主要通過抑制p27、p15 等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子活性，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控［20］。國(guó)外研究報(bào)道［21］，有超過90%宮頸癌組織皆可檢出HPV DNA。國(guó)際宮頸癌協(xié)會(huì)對(duì)宮頸癌患者展開大樣本研究［22］，發(fā)現(xiàn)有超過2/3 的宮頸癌均感染HPV 16 亞型或HPV 18 亞型。本研究通過對(duì)正常癌組織、CIN 及宮頸鱗癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常宮頸及CIN Ⅰ級(jí)患者宮頸鱗狀上皮組織基本上無或鮮少檢出HPV 表達(dá)；而隨CIN 級(jí)別的上升，HPV 陽(yáng)性率均上升，尤其宮頸癌組織HPV 陽(yáng)性率較高，提示HPV 陽(yáng)性率與宮頸病變程度存在緊密聯(lián)系，隨HPV 陽(yáng)性率的上升，宮頸病變程度增加，這與AFONSO 等［23］報(bào)道結(jié)論相似，提示HPV 感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變及癌性轉(zhuǎn)化存在緊密聯(lián)系。

表3 HPV 感染、EBV 感染、HPV+EBV 感染與宮頸癌發(fā)病的協(xié)同關(guān)系分析Tab.3 Synergetic relationship between HPV infection，EBV infection，HPV+EBV infection and the onset of cervical cancer

近期也有越來越多研究者提出，宮頸癌并非單一HPV 感染作用的結(jié)果，或可能與生殖道多重感染有關(guān)［24-25］。EBV 屬皰疹病毒科r 皰疹病毒，外形與其他皰疹病毒類似，含環(huán)形蛋白核心，包繞雙鏈DNA，主要感染B 淋巴細(xì)胞，亦可造成上皮細(xì)胞感染［26］。研究發(fā)現(xiàn)，EBV 長(zhǎng)期潛伏于淋巴細(xì)胞內(nèi)，并以環(huán)狀DNA 形式游離于胞漿內(nèi)，整合于宿主染色體內(nèi)，潛伏感染下，大多數(shù)細(xì)胞EBV DNA 處于潛伏狀態(tài)［27］。目前已被證實(shí)EBV 屬關(guān)鍵DNA 致瘤性病毒，存在細(xì)胞轉(zhuǎn)化效應(yīng)，參與鼻咽癌、B 細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病過程［28-29］。TOLIMAN 等［30］發(fā)現(xiàn)，精液可引起EBV 活化，同時(shí)含細(xì)菌宮頸黏液可能對(duì)EBV 活化存在協(xié)同效應(yīng)，故推測(cè)EBV 或可能與宮頸癌發(fā)病有關(guān)。WOESTENBERG 等［31］應(yīng)用PCR 技術(shù)對(duì)宮頸癌患者EBER1 mRNA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其組織EBER1 mRNA 檢出率超過70%，CIN 超過30%。MESHER 等［32］發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中約有3/5 存在EBV 感染。以上研究皆認(rèn)為EBV 或可能參與宮頸上皮癌變過程。本研究結(jié)果顯示，正常宮頸組織、CINⅠ級(jí)患者組織標(biāo)本基本上無EBV 感染；而隨宮頸上皮瘤變程度的增加，EBV 感染率增加，提示EBV 感染可能參與宮頸上皮內(nèi)瘤變癌性轉(zhuǎn)化過程，但對(duì)宮頸病變?cè)缙谑录?，諸如CINⅠ關(guān)系不大。本研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者癌組織HPV+EBV 重疊感染率高達(dá)65.31%，但在正常宮頸組織與CIN 中HPV+EBV 重疊感染率極低，故推測(cè)兩者雙重感染極有可能與宮頸癌發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步展開HPV、EBV 感染相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HPV 陽(yáng)性病例EBV 陽(yáng)性率較高，存在正性相關(guān)關(guān)系，說明HPV 感染與EBV 感染可能存在一定的互相影響及協(xié)同關(guān)系。進(jìn)一步進(jìn)行析因分析發(fā)現(xiàn)，HPV、EBV 感染協(xié)同參與宮頸癌發(fā)病過程，分析EBV 感染后其受體分布于宮頸上皮細(xì)胞，可能通過干擾p16 蛋白功能、上調(diào)bcl-2 表達(dá)引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，參與宮頸癌發(fā)?。?3］；而HPV 可通過引起p53 基因突變，引起宮頸癌變，兩者協(xié)同可能加速宮頸癌癌前病變進(jìn)程［34］。但對(duì)兩者重疊感染的對(duì)宮頸癌發(fā)病的確切機(jī)制及具體協(xié)同機(jī)制尚待進(jìn)一步研究論證。

綜上，CIN、宮頸癌發(fā)病皆與HPV 感染有關(guān)，而EBV 感染可能為高級(jí)別CIN 及宮頸癌發(fā)病的重要原因；且HPV、EBV 重疊感染與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，同時(shí)HPV、EBV 感染或可能存在協(xié)同機(jī)制，但本研究尚未對(duì)兩者是否存在協(xié)同具體機(jī)制展開研究，存在一定的局限性，對(duì)其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步展開試驗(yàn)論證。