袁啟龍 蔣滿波 陸杉 盧興宏 倪運(yùn)萍 周文 陳志強(qiáng)

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（廣州510006）

鑒于精子常規(guī)參數(shù)對于體外受精胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transplantation，IVF-ET）助孕結(jié)局的評估價值有限，IVF 治療過程中既往常忽視男性精子質(zhì)量因素對胚胎發(fā)育潛能的影響［1-2］，近幾年精子功能檢查指標(biāo)精子DNA 碎片（sperm DNA fragmentation，SDF）引入臨床檢查后，關(guān)于SDF 異常對胚胎發(fā)育潛能和IVF 助孕結(jié)局的影響多有報道［3-4］，但臨床針對SDF 異常的診治方案多為經(jīng)驗性治療，如輕中度精索靜脈曲張（varicocele，VC）所致SDF 異常采用手術(shù)治療效果尚存爭議，而臨床保守干預(yù)措施方面亦缺乏權(quán)威性診療規(guī)范，專家共識多集中在改善局部血液循環(huán)和抗氧化應(yīng)激方面［5-7］。本研究選取臨床常見且病因相對明確的輕中度VC 所致SDF 異?；颊咦鳛檠芯康耐黄瓶?，分析該類患者臨床常采用的保守干預(yù)措施是否能有效降低SDF，以及各保守干預(yù)措施之間的治療效果是否存有顯著差異，并分析各保守干預(yù)方案是否對后續(xù)IVF 助孕所獲取的胚胎質(zhì)量產(chǎn)生差異性影響，以評估該類患者進(jìn)行IVF助孕治療前的預(yù)處理是否有必要性及采用哪種干預(yù)更為合適。針對上述疑問，本研究特前瞻性設(shè)計分析比較臨床3 種常用保守干預(yù)措施的治療效果，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2019年10月期間在我科行IVF 助孕治療，完善病史詢問及相關(guān)檢查后診斷為輕中度VC 合并SDF 異常的患者，選取要求并采用保守干預(yù)后進(jìn)入IVF 治療周期的人群作為研究對象，共納入120 例。采用隨機(jī)數(shù)字表法將研究對象隨機(jī)分為邁之靈片治療組、維生素E 治療組和空白對照組，每組納入患者40 例，納入前均向患者告知干預(yù)措施隨機(jī)分組方式，詳細(xì)介紹各干預(yù)措施已知的研究報道，告知研究過程及各組干預(yù)可能的獲益等，并獲得患者知情同意，本研究已通過廣東省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批號：BF2018-027-01。

1.2 病例篩選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）輕中度VC 不育癥患者；（2）SDF＞30%；（3）男方年齡在23～42 歲之間；（4）配偶年齡21～38 歲，預(yù)計可獲取5 枚及以上卵子；（5）VC 所致SDF 異常選擇保守治療并自愿參加研究者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）排除其它致病因素所致SDF 異?；颊?；（2）排除先天性生殖系統(tǒng)畸形患者；（3）排除體質(zhì)量指數(shù)≥28 kg/m2的患者；（4）排除近期服用損害生育藥物或接觸有害環(huán)境并處于作用期的患者；（5）排除未能配合完整周期治療的患者。

1.3 主要試劑與儀器精子DNA 碎片測定試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司（批號：201706-201806），改良巴氏染色液購自南京欣迪公司；主要儀器為西班牙SCA 全自動精子質(zhì)量分析系統(tǒng)和尼康50i 相差顯微鏡。

1.4 精液常規(guī)和精子DNA 碎片分析囑咐患者禁欲3～7 d，用自慰方法將完整精液收集于無菌且干燥的容器內(nèi)，置于36 ℃恒溫箱進(jìn)行液化，液化后根據(jù)第5 版《WHO 人類精液檢查與處理實驗室手冊》標(biāo)準(zhǔn)評估精液常規(guī)參數(shù)［8］，采用精子染色質(zhì) 擴(kuò) 散（sperm chromatin dispersion，SCD）檢 測SDF，其檢驗原理是DNA 完整的精子在經(jīng)過變性和去掉核蛋白后DNA 擴(kuò)散形成特征性的光暈，而存在DNA 碎片的精子不會產(chǎn)生這種特征性的光暈，根據(jù)光暈的有無和大小判斷精子的DNA完整程度，具體操作參照深圳華康SDF 檢測試劑盒。

1.5 治療方法邁之靈片治療組：德國禮達(dá)大藥廠生產(chǎn)的邁之靈片（產(chǎn)品批號8324），口服，每次1粒，每日2 次，配合良好的生活習(xí)慣，連續(xù)干預(yù)12周；維生素E 治療組：浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn)的來益天然維生素E 膠囊（產(chǎn)品批號：150312），口服，每次1 粒，每日2 次，配合良好的生活習(xí)慣，連續(xù)干預(yù)12 周；空白對照組：良好的生活習(xí)慣，連續(xù)維持12 周。

1.6 指標(biāo)評估

1.6.1 治療前3 組精液參數(shù)比較3 組治療前精子參數(shù)是否具有可比性，具體指標(biāo)為精液量（semen volume，V）、精子濃度（sperm concentration，C）、前向運(yùn)動精子比例（progressive sperm rate，PR）、正常形態(tài)精子比例（normal sperm rate，N）、精子總數(shù)（total number of sperm，TNS）、前向運(yùn)動精子總 數(shù)（total number of progressive motility sperm，TNPS）、正常形態(tài)精子總數(shù)（total number of normal form sperm，TNNS）和SDF。

1.6.2 各組治療前后SDF 配對比較比較各組治療前后SDF 有無差異，以評估各組干預(yù)措施的對SDF 的治療效果。

1.6.3 治療后3 組精液常規(guī)參數(shù)及SDF 改善情況比較精子參數(shù)同1.6.1 所述，同時分析3 組干預(yù)對SDF 改善率和治愈率是否存有顯著性差異。SDF 療效評定標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)干預(yù)后SDF 在原來基礎(chǔ)上降低30%及以上或恢復(fù)正常，統(tǒng)稱為改善，恢復(fù)正常稱為治愈［9］。

1.6.4 治療后3 組行IVF 治療胚胎培養(yǎng)室指標(biāo)比較比較3 組配偶獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率有無差異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，治療前后兩樣本均數(shù)比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析檢驗（百分率統(tǒng)計采用平方根反正弦變換后分析）；SDF 改善率和治愈率，以及胚胎參數(shù)計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組治療前各項精液參數(shù)比較治療前3 組精液常規(guī)常規(guī)參數(shù)（單項指標(biāo)和總體參數(shù)）和SDF均無顯著差異，為表示區(qū)別，治療前上述精子參數(shù)英文簡寫后綴加1，3 組間各組基礎(chǔ)參數(shù)均衡，具有可比性，見表1。

表1 3 組治療前精子單項和總體參數(shù)比較Tab.1 Three groups comparison of sperm parameters before treatment ±s

表1 3 組治療前精子單項和總體參數(shù)比較Tab.1 Three groups comparison of sperm parameters before treatment ±s

注：其中PR1、N1 和SDF1 等百分率數(shù)據(jù)均數(shù)采用中位數(shù)，統(tǒng)計分析百分率采用平方根反正弦變換后方差檢驗

類別邁之靈組維生素E 組空白對照組F 值P 值V1 3.770±1.110 3.668±1.295 3.435±1.156 0.833 0.437 C1 53.315±35.250 55.488±43.426 58.530±27.795 0.211 0.810 TNS1 189.616±121.337 184.568±121.593 195.401±98.743 0.090 0.914 PR1（%）21.3 23.5 23.9 0.046 0.955 TNPS1 44.537±33.010 47.418±38.379 48.933±31.976 0.167 0.846 N1（%）2 2 1.5 1.178 0.311 TNNS1 3.800±3.400 4.608±4.247 3.610±2.743 0.907 0.407 SDF1（%）40.8 43.4 41.4 0.459 0.633

2.2 各組治療前后SDF 配對比較各組治療后SDF 均較之前差異有統(tǒng)計學(xué)意義，各組對于精索靜脈曲張導(dǎo)致的SDF 損傷均有改善作用，包括空白對照組生活習(xí)慣的調(diào)整，見表2。

表2 各組治療前后SDF 配對比較Tab.2 Each group SDF comparison before and after treatment%

2.3 3 組治療后各項精液參數(shù)、SDF 改善率及治愈率比較治療后3 組精液參數(shù)單項指標(biāo)差異均無顯著性意義；PR2 和TNPS23 組間差異無顯著性意義，但兩兩比較LCD 檢驗發(fā)現(xiàn)邁之靈組明顯高于空白對照組（P＜0.05）；3 組間SDF2 差異有顯著性意義，LCD 檢驗發(fā)現(xiàn)邁之靈組與其它兩組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其余治療后指標(biāo)差異未見顯著性意義，見表3。

2.4 3 組治療后胚胎培養(yǎng)室指標(biāo)比較不同預(yù)處理后，3 組間SDF 存有差異，邁之靈治療組優(yōu)質(zhì)胚胎率優(yōu)于維生素E 治療組和空白對照組，其余未見明顯異常，見表4。

3 討論

輔助生殖技術(shù)的臨床應(yīng)用為不孕癥夫婦提供了有效的助孕方案，既往關(guān)于影響成功率的因素研究多集中在女方卵巢功能、子宮內(nèi)膜環(huán)境和促排卵方案的選擇方面［10］，但臨床結(jié)局的提升難以實現(xiàn)進(jìn)一步的突破，近幾年發(fā)現(xiàn)精子的部分功能檢查指標(biāo)可能與胚胎的發(fā)育潛能存有相關(guān)性，其中報道較多的是SDF［11］。VC 是導(dǎo)致男性不育的重要因素之一，其引發(fā)的睪丸及其附件部位微循環(huán)障礙，可損害精子核遺傳物質(zhì)的完整性，傳統(tǒng)治療觀念認(rèn)為手術(shù)可解決解剖結(jié)構(gòu)的異常，特別是顯微手術(shù)的臨床應(yīng)用降低了VC 復(fù)發(fā)率。但近期研究認(rèn)為，對于輕中度VC 導(dǎo)致SDF 異常的手術(shù)治療，尚缺乏設(shè)計合理且證實優(yōu)于其他治療的臨床試驗，且臨床患者亦多傾向于藥物保守治療［12-13］。IVF 治療前對該類患者給予藥物的獲益程度，以及何種藥物的預(yù)處理更能有效改善胚胎的發(fā)育潛能尚無較多數(shù)據(jù)支持。

表3 3 組治療后精子單項和總體參數(shù)情況比較Tab.3 Three groups comparison of sperm parameters after treatment ±s

表3 3 組治療后精子單項和總體參數(shù)情況比較Tab.3 Three groups comparison of sperm parameters after treatment ±s

注：其中PR2、N2 和SDF2 等百分率數(shù)據(jù)均數(shù)采用中位數(shù)，PR2 和SDF2 統(tǒng)計分析采用平方根反正弦變換后方差檢驗；表示經(jīng)LCD 檢驗，與邁之靈組比較，*P＜0.05；SDF 改善率和治愈率分析采用χ2檢驗

類別邁之靈組維生素E 組空白對照組F/χ2值P 值V2 3.798±1.070 3.825±1.406 3.588±1.160 0.453 0.637 C2 69.343±40.267 67.715±46.068 60.503±28.253 0.585 0.559 TNS2 251.391±129.466 230.361±118.945 209.048±94.948 1.348 0.264 PR2（%）29.45 27.10 26.0*2.507 0.086 TNPS2 78.8346±46.967 65.3545±43.208 58.5888±34.611*2.418 0.094 N2（%）2 2 2 0.282 0.755 TNNS2 5.277±4.122 5.722±5.324 4.626±4.022 0.593 0.554 SDF2（%）30.15 33.60*33.40*4.334 0.015 SDF 改善率（%）55.0 40.0 42.5 2.081 0.353 SDF 治愈率（%）47.5 32.5 30.0 3.086 0.214

表4 3 組治療后胚胎質(zhì)量參數(shù)比較Tab.4 Three groups comparison of embryos quality after treatment

本研究中各組治療前、后配對比較，SDF 均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，分析原因在于精子膜含有高濃度的不飽和脂肪酸和低濃度的ROS 清除酶，精索靜脈曲張產(chǎn)生的過量ROS 易誘發(fā)脂類過氧化反應(yīng)，使脂肪酸失去雙鍵，從而破壞精子膜的流動性和精子DNA 完整性，此外VC 常因其它途徑導(dǎo)致精子生成和儲存環(huán)境破壞，如溫度升高、代謝毒性物質(zhì)返流、鎘的累積和免疫破壞等［14］，本研究各治療措施均可不同程度改善該類患者睪丸脈絡(luò)循環(huán)和精子產(chǎn)生微環(huán)境中的損傷因素。具體作用如下：調(diào)整良好的生活習(xí)慣包括避免抽煙、飲酒、熬夜、久坐及壓力過大等，適量的運(yùn)動有效促進(jìn)身體機(jī)能協(xié)調(diào)和局部微環(huán)境物質(zhì)的有效交換［15］；天然維生素E 含有生物活性高的D 型生育酚和生育三烯酚，可對抗生物膜上脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的自由基，保護(hù)生物膜的機(jī)構(gòu)和功能［16］；邁之靈片為馬栗提取物，其具有增加血管彈性和張力、抑制溶酶體活性、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞前列腺素分泌、拮抗氧自由基損傷等多作用途徑，改善局部微環(huán)境、減少ROS的堆積、維持精子膜穩(wěn)定性［17］。

干預(yù)后3組間精子常規(guī)參數(shù)比較差異無顯著性意義，僅組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，邁之靈組PR 和TNPS參數(shù)稍優(yōu)于空白對照組，而干預(yù)后3 組間SDF 存有顯著差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)邁之靈治療組干預(yù)后SDF 顯著低于另外兩組，但3 組間對于SDF 的改善率和治愈率卻無顯著差異。分析上述結(jié)果的原因可能在于以下3 個方面：（1）3 組預(yù)處理措施的具體作用途徑和原理不同，其治療效能亦存有區(qū)別?？瞻讓φ战M生活習(xí)慣改善有利于減輕VC 所致?lián)p傷，即通過改善該類患者睪丸組織局部微環(huán)境，部分程度可減少ROS 的產(chǎn)生、降低血管活性物質(zhì)的返流，以及穩(wěn)定局部免疫平衡，維生素E 則主要通過抗氧化應(yīng)激途徑，配合生活習(xí)慣改善后僅比空白對照組增強(qiáng)了抗氧化應(yīng)激損傷作用，而邁之靈片可改善脈絡(luò)循環(huán)和抑制溶酶體活性，配合生活習(xí)慣改善后可相對多環(huán)節(jié)降低精索靜脈曲張對生殖系統(tǒng)的破壞作用［15-17］。（2）VC 所致SDF 的產(chǎn)生具體機(jī)制相對復(fù)雜，其影響因素與精子生成、成熟以及精子儲存均有相關(guān)性［18］，目前臨床對于SDF的治療效果相對差于精子常規(guī)參數(shù)，各干預(yù)措施有效性差異在相對較難治療的SDF參數(shù)方面則更易凸顯。（3）3種干預(yù)措施對于SDF改善率和治愈率分別處于40%～55%和30%～47.5%水平，根據(jù)改善率和治愈率結(jié)果回顧性推算統(tǒng)計指標(biāo)的最低樣本量估算值，發(fā)現(xiàn)本研究納入患者樣本量不足夠多，以至SDF 的改善率和治愈率兩個參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)差異在本研究中未能充分體現(xiàn)，但納入組數(shù)量滿足干預(yù)后3 組SDF 的差異分析，其顯著性差異可在一定意義上表明3 種干預(yù)措施的治療效能有別。綜合考慮3種預(yù)處理的作用機(jī)制，精子漫長的生成周期和SDF 改善的相對復(fù)雜性，以及干預(yù)后SDF 的水平，初步認(rèn)為疊加效應(yīng)相對較強(qiáng)的邁之靈治療組對SDF 的改善作用存有優(yōu)勢，但具體優(yōu)勢作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，且需要大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步論證。

3 組卵子受精率和正常受精率指標(biāo)方面無顯著差異，原因在于卵子的受精情況與精液優(yōu)化處理后精子的常規(guī)參數(shù)和卵子的成熟度相關(guān)［19］，受精前需要把精子優(yōu)化處理并調(diào)整為合適精子數(shù)，兩組間調(diào)整后的精子參數(shù)無顯著差異，且兩組患者配偶年齡、獲取卵子數(shù)和成熟卵子數(shù)方面亦無顯著差異，則受精率無區(qū)別。3 組胚胎早期指標(biāo)卵裂率亦無區(qū)別，受精后胚胎早期發(fā)育潛能主要在于卵子的遺傳調(diào)控，有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞中母源性表觀遺傳因子受精后活性增強(qiáng)，其可促使合子DNA 發(fā)生重編程以及合子基因組的轉(zhuǎn)錄激活，在促進(jìn)受精后染色質(zhì)的結(jié)合分離發(fā)揮重要作用，卵子特異性連接組蛋白（H1foo）在卵子發(fā)育中減數(shù)分裂的完成、受精時精子染色質(zhì)的重構(gòu)、早期胚胎發(fā)育過程中的基因表達(dá)、染色質(zhì)表觀遺傳修飾等方面具有不可替代的作用［20］，現(xiàn)有觀點多認(rèn)為卵子在受精后胚胎早期發(fā)育階段起到主導(dǎo)作用［21］，與本研究結(jié)論一致。本研究顯示3 組間可利用胚胎率無顯著差異，而優(yōu)質(zhì)胚胎率存有顯著差異，邁之靈治療組優(yōu)質(zhì)胚胎率優(yōu)于另外兩組，其原因在于干預(yù)后邁之靈治療組SDF 明顯低于另外兩組，精子DNA 損傷對胚胎發(fā)育的影響逐漸在胚胎細(xì)胞階段顯現(xiàn)，SDF 異?？稍黾优咛グl(fā)育遲緩、胚胎碎片和胚胎非整倍體的發(fā)生率。

綜上所述，輕中度VC 所致SDF 異常行不同保守干預(yù)后，SDF 指標(biāo)存有顯著差異，改善局部微循環(huán)的治療方案優(yōu)于單一抗氧化應(yīng)激治療，鑒于不同保守預(yù)處理對后續(xù)IVF胚胎質(zhì)量的發(fā)育潛能產(chǎn)生差異影響，建議該類患者在行IVF 治療前選擇合適的保守預(yù)處理存有其必要性。當(dāng)然，如進(jìn)一步增加樣本量，且增加改善局部微循環(huán)配合抗氧化應(yīng)激治療組，可能更有利于指導(dǎo)臨床治療方案的優(yōu)化選擇。