蔡碧紅 王嘉勵 葉欣 付涌水 周振海

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州510080）；2廣州血液中心（廣州510080）

CD36 又稱為血小板糖蛋白4（GPⅣ），或血小板反應(yīng)蛋白（TSP）、Naka 受體等，是分子量為88 kD 的單鏈跨膜表面糖蛋白，屬于B 類清道夫受體跨膜蛋白家族，廣泛分布于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、紅系前體細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等［1］，參與脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、炎癥、動脈粥樣硬化和血栓形成等生理病理過程［2］。部分人群不表達(dá)CD36，根據(jù)CD36 表達(dá)缺失部位不同分為2 種類型：血小板和單核細(xì)胞均缺乏CD36 表達(dá)為Ⅰ型，僅在血小板上缺乏表達(dá)為Ⅱ型［3］。既往對CD36 的研究多集中在血管形成、血栓形成、動脈粥樣硬化、冠心病等方面，但隨著臨床研究的開展，發(fā)現(xiàn)CD36 表達(dá)缺失的個體可能通過輸血、妊娠、器官移植等途徑刺激機(jī)體產(chǎn)生抗CD36 同種免疫抗體，導(dǎo)致血小板輸注無效、輸血后紫癜、流產(chǎn)、新生兒同種免疫血小板減少癥。據(jù)報道，CD36 表達(dá)缺失主要發(fā)生在亞洲和非洲人種，而在白種人中罕見。為了解廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群CD36 表達(dá)缺失情況及建立已知CD36 抗原表型的血小板供者庫，筆者對廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血者進(jìn)行了CD36 表達(dá)的篩查。通過對1 485 例無償獻(xiàn)血者CD36 缺失情況的分析，了解廣州地區(qū)CD36 表達(dá)缺失的頻率，為進(jìn)一步探索CD36 抗體導(dǎo)致的血小板輸注無效奠定基礎(chǔ)。同時，對2 例CD36 抗體陽性的血小板輸注無效的臨床病例給予CD36 抗原陰性的血小板輸注，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料血液標(biāo)本來自廣州血液中心的1 485 例健康固定無償獻(xiàn)血者（累積捐獻(xiàn)血小板≥3次）。留取靜脈全血10 mL/例（EDTA 抗凝），采集血樣前均獲得獻(xiàn)血者的知情同意。2 例臨床病例為送廣州血液中心進(jìn)行血小板配型的血小板輸注無效患者。病例1 為女性，35 歲，A 型血型，骨髓增生異常綜合征患者，輸血史＞10 次，在輸注隨機(jī)機(jī)采血小板后出現(xiàn)血小板輸注無效（24 h 校正血小板增加指數(shù)（corrected count increment，CCI）＜4.5），伴有全身散在出血點。病例2 為男性，46 歲，B 型血型，酒精性肝硬化失代償期，肝移植半年后，腹腔感染入院，住院期間曾使用多種抗生素，輸血史＞10 次，在輸注隨機(jī)機(jī)采血小板后出現(xiàn)血小板輸注無效（24 h CCI＜4.5），并伴有眼結(jié)膜下片狀出血，全身散在出血點，以雙下肢明顯。

1.2 試劑和儀器FITC 熒光標(biāo)記的抗人CD36 單克隆抗體（批號mabFA6.152）和PE 熒光標(biāo)記抗人CD14 單克隆抗體（mab RMO52）（法國Beckman CouLter 公司）；ELISA 試劑盒（PAKPLUS，美國GTI Diagnostics 公司），MASPAT kit試劑盒（荷蘭Sanquin公司）；離心機(jī)（久保田5220，日本久保田公司）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoTMⅡ，美國BD公司）。

1.3 血小板的分離10 mL 抗凝全血經(jīng)100g離心15 min 后，分離出上層3/4 的富血小板血漿，并使用EDTA/PBS 緩沖液洗滌3 次，洗滌過的血小板重懸于EDTA/PBS 緩沖液并調(diào)整濃度使其達(dá)到1.0×105PLT/μL。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析CD36 在血小板和單核細(xì)胞上的表達(dá)取50 μL 上述血小板懸液，加入10 μL FITC 熒光標(biāo)記的抗人CD36 單克隆抗體，室溫孵育30 min。洗滌后，標(biāo)記的血小板重懸于1 mL EDTA/PBS 緩沖液中，上流式細(xì)胞儀檢測CD36 的表達(dá)。取100 μL EDTA 抗凝全血，加入10 μL FITC 熒光標(biāo)記的抗人CD36 單克隆抗體和PE 熒光標(biāo)記的CD14 單抗，室溫孵育20 min。隨后加入500 μL 裂解液，室溫孵育20 min 以去除紅細(xì)胞，加入4 mL EDTA/PBS緩沖液洗滌2次后，重懸于500 μL EDTA/PBS 緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測CD36 的表達(dá)。

1.5 ELISA 鑒定血小板同種抗體特異性按照ELISA 試劑盒說明書操作鑒定CD36 抗體，在包被有不同血小板糖蛋白（HLAⅠ類、GPⅡb/Ⅱa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPIV）的微量滴定孔中加入50 μL 稀釋血清（1∶3）。用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG（稀釋度1∶100）檢測結(jié)合抗體。抗體的特異性通過抗原捕獲ELISA 來確定。

1.6 血小板交叉配型2 例檢測出血小板CD36抗體陽性患者的血液標(biāo)本，與CD36 抗原陰性的血小板供者庫中的6 個單采血小板使用MASPAT kit試劑盒及羅廣平等自制的血小板交叉配型試劑盒［4］進(jìn)行交叉配型，并選擇相配合的CD36 抗原陰性的血小板進(jìn)行輸注。

1.7 輸注療效評價根據(jù)患者輸注前后CCI、血小板回收率（percentage platelet recovery，PPR）以及出血狀況有無改善綜合判斷。CCI=［（輸注后PLT-輸注前PLT）（109/L）×體表面積（m2）］/［輸注PLT 總數(shù)（1011/L）］；PPR=［（輸注后PLT-輸注前PLT）（109/L）×血容量（L）］/［輸注PLT 總數(shù)（1011/L）］×100%。體表面積=0.006 1×身高（cm）+0.012 8×體質(zhì)量（kg）-0.152 9，血容量=體表面積（m2）×2.5。輸注血小板后24 h CCI≥4.5、PPR≥20%以及出血癥狀明顯改善為輸注有效，否則視為輸注無效［5］。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀分析CD36 缺失情況在本次納入研究的1 485 例廣州地區(qū)健康無償獻(xiàn)血者中，共篩選出33 例血小板表面CD36 缺失的個體，其中17 例為血小板和單核細(xì)胞表面CD36 均缺失的個體，即CD36 表達(dá)缺失頻率為2.22%（33/1 485），其中Ⅰ型缺失所占比例為51.52%（17/33），Ⅱ型缺失所占比例為48.48%（16/33）。

2.2 2 例血小板輸注無效（PTR）患者血小板和單核細(xì)胞表面CD36 抗原表達(dá)情況流式細(xì)胞術(shù)檢測2 例PTR 患者血小板和單核細(xì)胞表面均缺乏CD36 表達(dá)，證實2 例患者均為CD36Ⅰ型缺失。

2.3 2 例PTR 患者血小板抗體檢測采用ELISA的方法檢測患者血清中的血小板抗體，HLAⅠ類、GPⅡb/Ⅱa、GPIa/Ⅱa、GPIb/Ⅸ孔均為陰性，僅GPⅣ孔為陽性，證實2 例患者血清均僅存在抗CD36抗體。

2.4 PTR 患者交叉配型血小板輸注效果觀察在分別給予輸注相配合的CD36 抗原陰性的單采血小板后，病例1 血小板計數(shù)明顯升高，24 h CCI 為35.84（≥4.5），PPR 為89.6%（≥20%）；病例2 全身未見新發(fā)出血點，且球結(jié)膜片狀出血逐漸吸收消退，全身出血點也消退好轉(zhuǎn)，其24 h CCI 為10.24（≥4.5），PPR 為25.6%（≥20%）。見表1。

表1 2 例PTR 患者輸注CD36 抗原陰性單采血小板后24 h CCI、PPR 及出血狀況改善情況Tab.1 Improvement of 24 h CCI，PPR and bleeding status after transfusion of CD36 antigen negative platelets in 2 PTR patients

3 討論

血小板輸注是針對各種原因?qū)е碌难“鍞?shù)量或功能異?；颊哳A(yù)防或治療出血的重要手段之一，但是多次甚至是頻繁輸注血小板會導(dǎo)致有效率減低［6］，易引起PTR。PTR 是指患者在連續(xù)2 次接受足夠劑量的血小板輸注后，仍處于無反應(yīng)狀態(tài)，臨床出血表現(xiàn)未見改善，血小板計數(shù)未見明顯增高，有時反而下降。PTR 往往與住院時間延長、住院費用增加［7］、出血風(fēng)險增加［8］、生存率降低［9］等一系列不良事件相關(guān)。導(dǎo)致PTR 的原因包括非免疫性因素（感染、高熱、抗生素、脾腫大、肝素等）和免疫性因素，包括人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）和CD36 抗原等引起的抗原抗體反應(yīng)［10］。引起PTR 的免疫原因是患者由于既往的輸血、妊娠、移植等產(chǎn)生了對供者血小板的同種異體免疫反應(yīng)，主要是針對人類白細(xì)胞抗原及血小板抗原［11］。第1 例被報道的CD36 抗原缺失導(dǎo)致的PTR 的病例來自1989年IKEDA 等［12］發(fā)現(xiàn)的1 例急性髓系白血病的女性患者，在輸注了HLA 配型的血小板后出現(xiàn)了PTR，其血清被檢測出抗-Naka 抗體，在輸注了Naka 陰性的血小板后其血小板計數(shù)得到了升高。隨后，陸續(xù)有研究報道了CD36 抗體介導(dǎo)的胎兒/新生兒血小板減少癥［13］、輸血相關(guān)急性肺損傷［14］等病例。CD36 缺失情況在不同地域、民族之間有很大區(qū)別，缺失主要發(fā)生在有色人種，亞洲地區(qū)發(fā)生率為3%～11%，非洲裔美國人約為8%，而高加索人不到0.3%［15］。中國處于亞洲CD36 表達(dá)缺失高發(fā)生率的地區(qū)，由CD36 抗體導(dǎo)致的PTR 同樣不容忽視。目前國內(nèi)已有成都、長春、上海、江蘇等地區(qū)對CD36 表達(dá)缺失情況進(jìn)行了調(diào)查分析，廣東地區(qū)亦有相關(guān)報道，但相對例數(shù)較少，因此筆者進(jìn)一步增加了調(diào)查的樣本量。通過篩查廣州地區(qū)1 485 名健康獻(xiàn)血者CD36 表達(dá)情況，以了解本地區(qū)人群CD36 表達(dá)缺失情況及建立已知CD36 表型的血小板供者庫，為臨床CD36 抗體介導(dǎo)的PTR 患者提供CD36 抗原陰性的血小板。

本研究在廣州地區(qū)1 485 名健康無償獻(xiàn)血者中，共篩查出33 例CD36 缺失的個體，即CD36 表達(dá)缺失頻率為2.22%（33/1485），其中Ⅰ型缺失頻率為1.14%，Ⅱ型缺失頻率為1.08%。MA 等［15］對北方地區(qū)人群的篩查中發(fā)現(xiàn)，612 例受試者中有13例出現(xiàn)Ⅱ型CD36 缺乏，頻率為2.12%。于曉麗等［16］對長春地區(qū)435 名無償獻(xiàn)血者CD36 表型的篩查中，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)CD36 缺失頻率為3.45%，Ⅰ型和Ⅱ型的缺失頻率分別為0.2%、3.2%。鐘周琳等在4 621 名廣西地區(qū)人群篩查中發(fā)現(xiàn)CD36 的總體缺失率是4.13%，其中漢族人群的缺失率為3.59%、壯族為5.76%、瑤族為2.38%［17］。而PHUANGTHAM 等［18］在泰國700 名獻(xiàn)血者的調(diào)查分析中發(fā)現(xiàn)CD36 缺失頻率為2.14%，Ⅰ型和Ⅱ型CD36 缺失的發(fā)生率分別為0.43%和1.71%。之所以本研究結(jié)果和上述報道有所不同，可能與不同地區(qū)，不同民族CD36 缺失的頻率不同有關(guān)。此外，既往部分報道除了對CD36 表達(dá)缺失的頻率進(jìn)行了調(diào)查，同時也分析了CD36 基因突變的位點。而CD36 的基因檢測作為CD36 相關(guān)研究的熱點問題，是本研究所欠缺的也是下一步要繼續(xù)深入研究和探討的。

本研究報道的2 例CD36 抗體介導(dǎo)的PTR 病例，患者既往都有多次的血小板輸注史，在輸注隨機(jī)機(jī)采血小板后，血小板計數(shù)沒有得到明顯提升，臨床出血癥狀未見改善。經(jīng)檢測，2 例患者血清中僅有CD36 抗體，且血小板和單核細(xì)胞上均缺乏CD36 表達(dá)，證實2 例患者均屬于Ⅰ型CD36 缺失。目前的研究認(rèn)為，產(chǎn)生CD36 抗體通常來自于Ⅰ型CD36 缺乏人群，而Ⅱ型CD36 缺乏者不會產(chǎn)生抗CD36 抗體［19］。隨后，筆者給予2 例患者輸注CD36抗原陰性的血小板，血小板計數(shù)均得到了提升，臨床出血癥狀亦明顯改善。這2 個臨床病例證實了通過輸注CD36 抗原陰性的血小板確實能夠改善血小板輸注的有效率。除了輸注交叉配型的CD36 抗原陰性血小板的治療策略，還有病例報道表明用靜脈注射用免疫球蛋白和利妥昔單抗進(jìn)行免疫抑制治療也可以改善PTR 的問題［20］。

盡管目前僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)PTR 病例是由于CD36抗體所致，但其重要性仍不可忽視。臨床遇到高度懷疑免疫因素導(dǎo)致的PTR 病例時，除了常規(guī)篩查HLA 抗體和HPA 抗體外，還應(yīng)該將CD36 抗體也納入考慮。若檢測到CD36 抗體，應(yīng)檢測患者血小板和單核細(xì)胞上CD36 表達(dá)情況，并給予CD36抗原陰性的血小板輸注。同時，有條件的采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)建立CD36 陰性的血小板供者庫，以便能夠及時為CD36 抗體介導(dǎo)的PTR 的患者提供相合的血小板，以提高輸血效果、減少出血風(fēng)險和保證輸血安全。