步楠 范彥秋 趙春紅

佳木斯市中心醫(yī)院消化內(nèi)科（黑龍江佳木斯154002）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一類發(fā)病機制未完全闡明的非特異性炎癥性腸病，臨床上也缺乏特效的治療手段?，F(xiàn)有的研究認為炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答異常、腸道菌群紊亂、腸黏膜屏障破壞與UC 的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。布拉氏酵母菌是具有耐熱耐酸特性的微生態(tài)制劑，進入腸道后能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，已有研究報道布拉氏酵母菌用于UC 小鼠治療能夠抑制腸道炎癥反應(yīng)、改善腸黏膜屏障功能［3-4］，但布拉氏酵母菌發(fā)揮上述治療作用的機制仍未闡明。因此，本研究將對布拉氏酵母菌治療UC 的分子機制進行深入探討。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，PK包括PKL、PKR、PKM1、PKM2四種亞型，其中PKM2還具有轉(zhuǎn)錄輔助因子的作用，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中參與細胞增殖、凋亡的調(diào)控。近年來有研究報道PKM2 表達異常與UC 的發(fā)病有關(guān)，在UC患者腸黏膜中，PKM2的表達明顯減少；在葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中，敲除PKM2 能夠加重腸黏膜炎癥、破壞腸黏膜上皮緊密連接、增加炎癥因子含量［5］。本課題組前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，布拉氏酵母菌對腸黏膜中PKM2 的表達具有促進作用，但目前關(guān)于布拉氏酵母菌是否通過PKM2 在UC 治療中發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、改善黏膜屏障的作用仍未明確。為此，本實驗將以腸道特異性PKM2 基因敲除小鼠為對象，一方面驗證布拉氏酵母菌治療UC 的作用，另一方面探究布拉氏酵母菌治療UC 的機制，旨在為今后臨床使用布拉氏酵母菌治療UC的奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物野生型C57BL/6J 小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物公司，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2018-0006；Villin-Cre 小鼠（遺傳背景C57BL/6J）、PKM2FLOX/+小鼠（遺傳背景C57BL/6J）購自上海南方模式生物科技公司。

1.2 試劑與儀器布拉氏酵母購自法國百科達制藥廠，HE 染色試劑盒購自上海歌凡生物，RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海貝博生物科技公司，閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens protein 1，ZO-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、Claudin-1 的單克隆抗體購自Abcam 公司，二胺氧化酶、D-乳酸、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）試劑盒購自上海西唐公司。

1.3 方法

1.3.1 腸道特異性PKM2 基因敲除小鼠的獲取Villin-Cre 小鼠與PKM2FLOX/+小鼠同籠，獲得PKM2+/+Cre+、PKM2FLOX/+Cre+、PKM2FLOX/FLOXCre+的后代小鼠，剪取尾巴末端約0.5 cm，采用基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，采用北京唯德生物科技有限公司提供的引物對DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物為一條帶的即為PKM2FLOX/FLOXCre+小鼠，Cre 酶可以剪切PKM2 兩個loxP位點間的序列，進而實現(xiàn)PKM2基因的敲除。

1.3.2 動物分組、造模及給藥野生型C57BL/6J小鼠隨機分為PKM2-WT 組、PKM2-WT+UC 組、PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組，PKM2FLOX/FLOX-Cre+小鼠隨機分為PKM2-KO 組、PKM2-KO+UC組、PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組，每組各10只。UC 造模方法如下：自由引用含有2.5%DSS 的高壓滅菌飲用水、連續(xù)7 d；布拉氏酵母菌組干預(yù)方法如下：2.6×107CFU/mL 布拉氏酵母菌液0.2 mL/次灌胃、2 次/d、連續(xù)7 d。

1.3.3 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）的評估開始造模及干預(yù)后，每天觀察小鼠進食、飲水、活動等一般狀況，稱重并記錄，觀察糞便性狀及便血情況，參照HARNAMOTO 等［6］的標(biāo)準(zhǔn)進行DAI 評分，DAI 評分越高、UC 病情越重。

1.3.4 腸黏膜HE 染色及組織病理評分造模后處死小鼠，收集適量結(jié)腸組織，生理鹽水清洗后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋并切片，HE 染色后在400 倍顯微鏡下觀察腸黏膜的病理改變，參照文獻進行組織病理評分，包括中性粒細胞及淋巴細胞浸潤0～3 分、潘氏細胞和杯狀細胞脫顆粒0～2分、上皮細胞反應(yīng)0～3 分、炎癥病灶0～3 分，各項評分相加即為組織病理評分，評分越高、腸黏膜病理損傷越重。

1.3.5 血清中二胺氧化酶、D-乳酸含量的檢測造模后處死小鼠，收集外周血3～5 mL，靜置0.5 h后3 000 r/min 離心獲得血清樣本，采用Elisa 試劑盒測定血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）的含量。

1.3.6 腸黏膜中PKM2、ZO-1、Occludin、Claudin-1表達的檢測另取適量結(jié)腸組織，分離腸黏膜后采用RIPA 裂解液提取組織中的蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白測定蛋白含量，取含有20 μg 蛋白的樣本進行Western Blot，將樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠后進行電泳、電轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 小時PKM2、ZO-1、Occludin、Claudin-1 一抗4 ℃孵育PVDF 膜過夜。次日，HRP 二抗室溫孵育PVDF 膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計算蛋白表達量。

1.3.7 腸黏膜中TNF-α、IL-1β 含量的Elisa 檢測按照1.3.6 中相同的方法獲得腸黏膜組織的蛋白樣本并測定蛋白含量，采用Elisa 試劑盒測定TNF-α、IL-1β 的含量，計算每毫克蛋白中TNF-α、IL-1β 的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有條件學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠DAI 的比較第3 天起，PKM2-WT+UC 組小鼠的DAI 明顯高于PKM2-WT 組（P＜0.05），PKM2-KO+UC 組小鼠的DAI 評分均低于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；第4 天起，PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組小鼠的DAI 明顯低于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05），PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠的DAI 明顯高于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組（P＜0.05）；PKM2-KO 組小鼠的DAI 評分與KM2-WT 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠DAI 的比較Fig.1 Comparison of DAI among each groups

2.2 各組小鼠腸黏膜中PKM2 表達的比較PKM2-WT+UC 組小鼠腸黏膜中PKM2 的表達量明顯低于PKM2-WT 組（P＜0.05）；PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜中PKM2 的表達量明顯高于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）。PKM2-KO組、PKM2-KO+UC 組、PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜中PKM2 均不表達。

圖2 各組小鼠腸黏膜中PKM2 表達的比較Fig.2 Comparison of PKM2 expression in intestinal mucosa among each groups

2.3 各組小鼠腸黏膜HE 染色及組織病理評分的比較PKM2-WT+UC 組小鼠腸黏膜的組織病理評分明顯高于PKM2-WT 組（P＜0.05）；PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜的組織病理評分明顯低于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜的組織病理評分明顯高于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC 組小鼠腸黏膜的組織病理評分明顯高于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO 組小鼠腸黏膜的組織病理評分與KM2-WT 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠血清中DAO、D-LA 含量的比較PKM2-WT+UC 組小鼠血清中DAO、D-LA 的含量明顯高于PKM2-WT 組（P＜0.05）；PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組小鼠血清中DAO、D-LA 的含量明顯低于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠血清中DAO、D-LA的含量明顯高于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC 組小鼠血清中DAO、D-LA 的含量明顯高于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO 組小鼠血清中DAO、D-LA 含量與PKM2-WT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 各組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 表達量的比較PKM2-WT+UC 組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達量明顯低于PKM2-WT 組（P＜0.05）；PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達量明顯高于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達量明顯低于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC 組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達量明顯低于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO 組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達量與PKM2-WT 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠腸黏膜的HE 染色（×100）Fig.3 HE staining of intestinal mucosa of each groups（×100）

表1 各組小鼠腸黏膜組織病理評分的比較Tab.1 comparison of histopathological score of intestinal mucosa among each groups ±s

表1 各組小鼠腸黏膜組織病理評分的比較Tab.1 comparison of histopathological score of intestinal mucosa among each groups ±s

注：與PKM2-WT 組比較，*P＜0.05；與PKM2-WT+UC 組比較，#P＜0.05；與PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組比較，&P＜0.05

組別PKM2-WT 組PKM2-WT+UC 組PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組PKM2-KO 組PKM2-KO+UC 組PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組例數(shù)10 10 10 10 10 10組織病理評分0 6.12±0.93*2.51±0.62#0.84±0.14 8.64±1.32#5.12±0.98&

表2 各組小鼠血清中二胺氧化酶、D-乳酸含量的比較Tab.2 Comparison of serum diamine oxidase，D-lactate contents among each groups ±s

表2 各組小鼠血清中二胺氧化酶、D-乳酸含量的比較Tab.2 Comparison of serum diamine oxidase，D-lactate contents among each groups ±s

注：與PKM2-WT 組比較，*P＜0.05；與PKM2-WT+UC 組比較，#P＜0.05；與PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組比較，&P＜0.05

組別PKM2-WT組PKM2-WT+UC組PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組PKM2-KO組PKM2-KO+UC組PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組例數(shù)10 10 10 10 10 10 DAO（U/mL）2.09±0.54 5.69±0.95*3.11±0.74#2.18±0.52 8.14±1.26#5.41±0.94&D-LA（μg/mL）1.03±0.29 1.88±0.35*1.32±0.27#1.07±0.22 2.14±0.42#1.71±0.42&

圖4 各組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的蛋白條帶Fig.4 Protein bands of ZO-1，Occludin，Claudin-1 in intestinal mucosa of each groups

表3 各組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 表達量的比較Tab.3 Comparison of ZO-1，Occludin，Claudin-1 expression in intestinal mucosa among each groups ±s

表3 各組小鼠腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1 表達量的比較Tab.3 Comparison of ZO-1，Occludin，Claudin-1 expression in intestinal mucosa among each groups ±s

組別PKM2-WT 組PKM2-WT+UC 組PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組PKM2-KO 組PKM2-KO+UC 組PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組例數(shù)10 10 10 10 10 10 ZO-1 0.93±0.15 0.52±0.09*0.91±0.18#0.95±0.14 0.33±0.08*0.58±0.09&Occludin 0.83±0.15 0.38±0.09*0.78±0.12*0.81±0.16 0.21±0.06*0.39±0.08&Claudin-1 0.89±0.13 0.40±0.08*0.80±0.14*0.87±0.15 0.25±0.06*0.71±0.13&

2.6 各組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 含量的比較PKM2-WT+UC 組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β的含量明顯高于PKM2-WT 組（P＜0.05）；PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 的含量明 顯低于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 的含量明顯高于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組（P＜0.05）；PKM2-KO+UC 組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 的含量明顯高于PKM2-WT+UC 組（P＜0.05）；PKM2-KO 組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 的含量與PKM2-WT 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 含量的比較Tab.4 Comparison of TNF-α、IL-1β contents in intestinal mucosa among each groups±s

表4 各組小鼠腸黏膜中TNF-α、IL-1β 含量的比較Tab.4 Comparison of TNF-α、IL-1β contents in intestinal mucosa among each groups±s

注：與PKM2-WT 組比較，*P＜0.05；與PKM2-WT+UC 組比較，#P＜0.05；與PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組比較，&P＜0.05

組別PKM2-WT 組PKM2-WT+UC 組PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組PKM2-KO 組PKM2-KO+UC 組PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組例數(shù)10 10 10 10 10 10 TNF-α（ng/mg）1.62±0.41 5.24±0.93*2.56±0.65#1.55±0.34 7.96±1.17#6.01±0.95&IL-1β（ng/mg）0.93±0.22 4.12±0.87*2.04±0.55#1.01±0.25 8.29±1.36#5.94±0.94&

3 討論

UC 的發(fā)病與炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的異常、腸道菌群的紊亂、腸黏膜屏障的損害有關(guān)［7-8］。近年來，益生菌在UC 治療中的價值受到了越來越多關(guān)注，其中布拉氏酵母菌是一種具有耐酸耐熱性能的益生菌［9-11］，已經(jīng)被證實能夠在UC 小鼠的治療中改善腸黏膜病理改變、減輕腸黏膜炎癥反應(yīng)及腸黏膜屏障損害［3-4］。本實驗在DSS 誘導(dǎo)小鼠發(fā)生UC 后給予布拉氏酵母菌灌胃干預(yù)，觀察到的結(jié)果與闕雪梅等［3］的研究一致，即布拉氏酵母菌干預(yù)后UC 小鼠的DAI 評分、腸黏膜組織病理評分均降低，說明布拉氏酵母菌能夠在UC 中發(fā)揮治療作用。因此，本實驗也將在此基礎(chǔ)上進一步研究布拉氏酵母菌發(fā)揮治療作用的分子機制，這也是本實驗的創(chuàng)新性所在。

PKM2 是PK 的亞型之一，既能作為催化酶參與糖酵解過程，也能夠作為轉(zhuǎn)錄輔助因子參與下游基因表達的調(diào)控過程并改變細胞的增殖、凋亡、有絲分裂等。在食管癌、前列腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤中，PKM2 表達增多，具有促增殖、抗凋亡、促侵襲作用，與腫瘤的病理特征密切相關(guān)［12-14］；而在UC 患者腸黏膜中，PKM2 的表達明顯減少，由其介導(dǎo)的促增殖、抗凋亡作用減弱并引起腸黏膜上皮細胞過度凋亡。本實驗對腸黏膜中PKM2 表達的分析發(fā)現(xiàn)：UC 小鼠腸黏膜中PKM2 的表達減少，而布拉氏酵母菌干預(yù)后腸黏膜中PKM2 的表達增加，說明PKM2 表達減少與UC 的發(fā)病有關(guān)且布拉氏酵母菌能夠增加PKM2 的表達，進而也提示增加PKM2 的表達可能是布拉氏酵母菌發(fā)揮UC 治療作用的分子機制。

為了驗證PKM2 在UC 發(fā)病及布拉氏酵母菌治療UC 中的作用，本實驗通過LoxP-Cre 系統(tǒng)將腸黏膜中的PKM2 基因進行特異性敲除，僅敲除PKM2基因的小鼠并未出現(xiàn)腸黏膜病理改變；而在敲除PKM2 基因后，使用DSS 誘導(dǎo)UC 過程中DAI 增加、腸黏膜病理損害加重，與Sun X 的動物實驗結(jié)果吻合，進一步驗證了PKM2 基因表達減少與UC 的發(fā)病密切相關(guān)。在PKM2 基因小鼠中建立UC 模型后，給予布拉氏酵母菌干預(yù)同樣能夠使DAI 評分、腸黏膜組織病理評分降低，但降低的效果與布拉氏酵母菌用于野生型小鼠明顯減弱，即PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠腸黏膜的DAI 評分、組織病理評分明顯高于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組。由此說明敲除PKM2 給予能夠削弱布拉氏酵母菌改善UC 病情及腸黏膜病理改變的作用，進而提示布拉氏酵母菌通過PKM2發(fā)揮治療UC 的作用。

腸黏膜屏障損害、炎癥反應(yīng)激活是UC 疾病的病理特征，在病理特征進展的過程中，多種相關(guān)分子的含量及表達會發(fā)生相應(yīng)變化。DAO 是特異性表達于腸黏膜上皮細胞的代謝酶、D-LA 是腸道內(nèi)細菌發(fā)酵代謝的產(chǎn)物，在腸黏膜屏障損傷時大量釋放進入血液循環(huán)［15］；ZO-1、Occludin、Claudin-1 是腸黏膜上皮表達的緊密連接蛋白，其表達減少會造成腸黏膜屏障功能損害［16-18］；TNF-α 及IL-1β 是重要的促炎細胞因子，在腸道菌群發(fā)生紊亂、炎癥細胞在腸黏膜內(nèi)大量浸潤的過程中不斷分泌，進而加重腸黏膜的病理改變［19-22］。上述分子在UC 中的變化已經(jīng)被多項研究證實，本實驗中UC 小鼠的上述指標(biāo)也發(fā)生了相應(yīng)變化；在布拉氏酵母菌干預(yù)后，DAO、D-LA、TNF-α及IL-1β的含量減少，ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達增加，由此驗證了布拉氏酵母菌治療UC 的作用。在UC 小鼠中，敲除PKM2 基因后上述指標(biāo)的變化加劇，DAO、D-LA、TNF-α 及IL-1β 的含量進一步增加，ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達進一步減少，說明PKM2 在UC 中參與了腸黏膜炎癥反應(yīng)及黏膜屏障的調(diào)控。而在敲除PKM2 基因的UC 小鼠中，布拉氏酵母菌調(diào)節(jié)上述分子的作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，即PKM2-KO+UC+布拉氏酵母菌組小鼠DAO、D-LA、TNF-α及IL-1β 的含量均高于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組，而ZO-1、Occludin、Claudin-1 的表達均低于PKM2-WT+UC+布拉氏酵母菌組。由此說明布拉氏酵母菌改善腸黏膜屏障功能、抑制腸黏膜內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用與增加PKM2 基因表達有關(guān)。

綜上所述，布拉氏酵母菌治療DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠能夠改善腸黏膜病理改變、減輕炎癥反應(yīng)及黏膜屏障損傷，同時布拉氏酵母菌能夠增加UC 小鼠腸黏膜中PKM2 的表達；敲除PKM2 基因后，布拉氏酵母菌的治療作用減弱或消失，進而表明布拉氏酵母菌治療UC 的作用與增加PKM2 的表達有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了布拉氏酵母菌通過PKM2 基因發(fā)揮UC 治療價值，這是本研究的創(chuàng)新性所在，但PKM2 基因在UC 發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍有待進一步研究，今后可在PKM2 基因敲除小鼠中研究PKM2 調(diào)節(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)及腸黏膜屏障的機制。