孫樂科 胡琳鳳 史欣甜 冷爾玲

南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院兒科（南昌330006）

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種兒童中最常見的惡性腫瘤，其中85%為B 淋巴細(xì)胞白血病，15%為T 淋巴細(xì)胞白血?。?］。近十多年來兒童白血病的治療也取得較大的進(jìn)展，五年生存率也達(dá)到80%［2］，但是仍有15%～20%患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，并且出現(xiàn)耐藥［3］。由于高強(qiáng)度的遺傳毒性化療藥物的使用，部分ALL患兒還將誘發(fā)二次腫瘤以及其他健康問題，尤其是在T-ALL 中［4］。因此需要有效而且低毒副作用的治療策略提高患兒的生存率以及生存質(zhì)量。

X 染色體連鎖的凋亡抑制（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，能選擇性抑制細(xì)胞凋亡途徑上游啟動(dòng)分子Caspase-9和下游效應(yīng)分子Caspase-3，Caspase-7 的活性，抑制細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞對(duì)化療產(chǎn)生耐藥［5-6］。AT-406是一種XIAP 蛋白的小分子化合物，通過與XIAP蛋白中BIR3 結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制與細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-9 的結(jié)合，并且可以增強(qiáng)治療敏感性［7］。通過抑制XIAP 的表達(dá)可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡［8-9］，然而XIAP 蛋白小分子抑制劑對(duì)ALL 細(xì)胞的抑制作用鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究將XIAP 作為克服耐藥的理想靶標(biāo)，通過XIAP 抑制劑AT-406 作用于T-ALL 細(xì)胞株6T-CEM，體外實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)藥物反應(yīng)性的影響，并初步探討其抗白血病作用機(jī)制，為XIAP 抑制劑的臨床應(yīng)用以及ALL 的臨床治療策略的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器XIAP 抑制劑AT-406（上海碧云天生物），人白血病6T-CEM 細(xì)胞株（武漢博士德公司），胎牛血清（杭州四季青），RPMI-1640 培養(yǎng)基（北京索萊寶公司），細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)CORNING 公司），CCK-8 試劑盒（上海AbMole 公司），Annexin V-PE/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司），Caspase-3 酶活性檢測(cè)試劑盒（南京凱基公司），兔抗人GAPDH、Caspase-3 一抗（美國(guó)abcam 公司），羊抗兔標(biāo)記HRP 二抗（北京索萊寶公司），抗體稀釋液和封閉液（上海碧云天生物），ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（南京凱基公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器），倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS 公司），CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；垂直電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽（美國(guó)BioRad 公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）。

1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)白血病6T-CEM 細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的6T-CEM 細(xì)胞并用10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/mL，XIAP 抑制劑AT-406按照說明書加入DMSO 溶解，單藥組加入AT-406溶液使終濃度分別為0、0.1、1 和10 μmol/L，聯(lián)合組中加入不同濃度AT-406 以及20 nmol/L 依托泊苷，混勻后鋪種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔種植體積為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，孵育2 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分析不同濃度XIAP 抑制劑對(duì)6T-CEM 細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值÷對(duì)照組OD值）×）組增殖。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的6T-CEM 細(xì)胞，按1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。單藥組分別加入終濃度為1 μmol/L 的AT-406 使和20 nmol/L 依托泊苷，聯(lián)合組同時(shí)加入1 μM AT-406 和20 nmol/L 依托泊苷，對(duì)照組加入同體積DMSO。37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，離心后去上清收集細(xì)胞，PBS 緩沖液清洗后加入預(yù)冷的1×Binding buffer 懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，取0.5 mL 細(xì)胞懸液并加入5 μL PE-Annexin V 和10 μL 7-AAD，室溫避光孵育15 min 后，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.4 Caspase-3 酶活性檢測(cè)按照上述1.3 方法培養(yǎng)并收集細(xì)胞，收集細(xì)胞并用PBS 緩沖液清洗1次，離心收集細(xì)胞并用PBS 緩沖液清洗后，加入Lysis Buffer（含有DTT）于冰上裂解1 h，離心取上清后應(yīng)用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。按照說明書步驟取等量裂解液，加入PBS 補(bǔ)充體積到50 μL，加入50 μL 2×Reaction Buffer 和50 μL Caspase-3 Substrate，37 ℃避光孵育4 h，用酶標(biāo)儀于400 nm處測(cè)定其吸光度。OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組的倍數(shù)確定Caspase-3 的活化程度。

1.5 Western Blot 檢測(cè)按照上述1.4 方法培養(yǎng)并收集細(xì)胞，離心收集細(xì)胞并用PBS 緩沖液清洗后，加入RAPI 裂解液（含有蛋白酶抑制劑PMSF）于冰上裂解1 h，離心取上清后應(yīng)用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取20 μg 的蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠孔道中，并進(jìn)行電泳，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF 膜置于封閉液中，室溫封閉1 h。按照抗體說明書中建議的使用濃度，用抗體稀釋液配置一抗工作液，并將PVDF 膜置于工作液中4 ℃孵育過夜；PBST 緩沖液PVDF 膜后，置于二抗工作液中室溫孵育2 h；PBST緩沖液漂洗后進(jìn)行顯影；用Image J 圖像分析軟件分析格條帶的光密度值，并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組間的差異，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XIAP 抑制劑AT-406 增強(qiáng)依托泊苷對(duì)6TCEM 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用CCK-8 比色法檢測(cè)不同濃度的AT-406 單藥以及聯(lián)合20 nmol/L 依托泊苷對(duì)6T-CEM 細(xì)胞增殖的影響，檢測(cè)結(jié)果顯示0.1、1、10 和100 μmol/L 的XIAP 抑制劑AT-406 處理6TCEM 細(xì)胞24 h 后的抑制率分別為（4.19±1.96）%、（8.01±0.17）%、（10.03±1.74）%和（14.77±1.50）%。依托泊苷聯(lián)合不同濃度AT-406 為（27.33±5.00）%、（33.32±1.88）%和（37.27±2.16）%，明顯高于依托泊苷單藥處理組（13.18±3.61）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示XIAP 抑制劑AT-406 可以增強(qiáng)依托泊苷對(duì)6T-CEM 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（圖1）。

2.2 XIAP 抑制劑AT-406 誘導(dǎo)6T-CEM 細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)1 μmol/L 濃度的AT-406、20 nmol/L 依托泊苷單藥以及聯(lián)合處理6T-CEM 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)情況。結(jié)果顯示1 μmol/L 濃度AT-406、20 nmol/L 依托泊苷以及聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率（Annexin V 陽性細(xì)胞比率）分別為（17.5±1.86）%、（43.7±3.91）%、（66.0±2.08）%，明顯高于對(duì)照組（12.0±2.14）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)果提示XIAP 抑制劑AT-406 可以促進(jìn)依托泊苷對(duì)6T-CEM 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，見圖2。

2.3 XIAP 抑制劑AT-406 增強(qiáng)6T-CEM 細(xì)胞Caspase-3 中酶活性6T-CEM 細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L 濃度的AT-406、20 nmol/L 依托泊苷單藥以及聯(lián)合處理24 h后，應(yīng)用比色法測(cè)定Caspas-3 酶活性，結(jié)果顯示AT-406 單藥組中Caspas-3 酶活性高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；依托泊苷單藥組以及聯(lián)合處理組中Caspas-3 酶活性明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合處理組中Caspas-3 酶活性明顯高于依托泊苷單藥組對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。結(jié)果表明XIAP 抑制劑可以增強(qiáng)依托泊苷均對(duì)細(xì)胞中Caspase-3 酶活性的激活作用。

圖1 AT-406 和依托泊苷對(duì)6T-CEM 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 The effects of AT-406 and etoposide on growth inhibition rate of 6T-CEM cells

圖2 AT-406 增強(qiáng)依托泊苷對(duì)6T-CEM 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用Fig.2 AT-406 enhances the effect of etoposide on apoptosis of 6T-CEM cells

2.4 XIAP 抑制劑AT-406 誘導(dǎo)6T-CEM 細(xì)胞Cleaved-Caspase-3 蛋白的表達(dá)6T-CEM 細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L 濃度的AT-406、20 nmol/L 依托泊苷單藥以及聯(lián)合處理24 h 后，Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3 活化狀態(tài)Cleaved-Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示XIAP 抑制劑單藥處理組中Cleaved-Caspase-3 水平與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；依托泊苷單藥以及聯(lián)合處理組中Cleaved-Caspase-3 表達(dá)水平明顯上調(diào)，而且聯(lián)合組中Cleaved-Caspase-3 表達(dá)水平高于依托泊苷單藥處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖3 AT-406 增強(qiáng)依托泊苷對(duì)6T-CEM 細(xì)胞中Caspase-3 酶活性的激活作用Fig.3 AT-406 enhances the activation of Caspase-3 enzyme activity in 6T-CEM cells by etoposide

圖4 AT-406 增強(qiáng)依托泊苷對(duì)Cleaved-Caspase-3 蛋白的上調(diào)表達(dá)的誘導(dǎo)作用Fig.4 The effect of AT-406 on the expression of Cleaved-Caspase-3 protein in 6T-CEM cells

3 討論

在T 細(xì)胞分化過程中，癌基因異常激活、抑癌基因的缺失表達(dá)，將導(dǎo)致細(xì)胞分化阻滯和免疫細(xì)胞克隆性擴(kuò)增，最后導(dǎo)致T-ALL 的形成。這種血液腫瘤具有高度異質(zhì)性，具有廣泛的遺傳缺失和表觀遺傳學(xué)改變，共同促使T 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變。T-ALL 在兒童ALL 中總體存活率為85%～90%，主要表現(xiàn)縱隔腫塊和髓外淋巴結(jié)以及其他部位出現(xiàn)浸潤(rùn)，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)［10］。目前T-ALL 的治療方案仍為大劑量的化療，高危及難治患兒選擇造血干細(xì)胞移植。在誘導(dǎo)化療期間，大量白血病細(xì)胞將通過糖皮質(zhì)激素、天冬酰胺酶和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合治療得到根除［11］。

Notch1被認(rèn)為是T-ALL發(fā)生發(fā)展過程中最重要的基因之一，因?yàn)槠湓?0%以上的T-ALL 患者中均檢測(cè)到突變［12］。T-ALL中持續(xù)激活的Notch1可以通過調(diào)控IKK復(fù)合物以及轉(zhuǎn)錄水平激活NF-кB信號(hào)途徑［13］。在對(duì)B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血?。˙-CLL）的研究中發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)途徑持續(xù)激活，同時(shí)伴隨這NF-кB信號(hào)途徑的活化以及下游抗凋亡蛋白的上調(diào)表達(dá)，例如細(xì)胞抑制蛋白-2（c-IAP2）和XIAP［14］。XIAP 作為NF-кB 信號(hào)途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因，對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程具有抑制作用［15-16］。因此，NF-кB可能作為重要的介導(dǎo)因子參與Notch突變誘導(dǎo)的T-ALL 形成過程，并參與白血病細(xì)胞的存活和抗凋亡進(jìn)程，抑制NF-кB 信號(hào)途徑以及下游信號(hào)分子可能作為重要的靶標(biāo)用于臨床治療。

X-連鎖凋亡抑制因子（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）其通過與半胱天冬酶（Caspase）相結(jié)合并抑制酶活性。然而，XIAP 還參與其他不依賴于Caspase 抑制作用的細(xì)胞進(jìn)程［17］。腫瘤細(xì)胞中表達(dá)一種或者多種IAP 家族蛋白，是表現(xiàn)出抗凋亡作用的機(jī)制之一。XIAP 作為IAP 家族成員之一可以直接與Caspase 結(jié)合（Caspase-9、Caspase-7和Caspase-3），從而抑制內(nèi)源性或者外源性細(xì)胞凋亡途徑。鑒于其抗凋亡作用，并且在多種腫瘤中表達(dá)特征，通過小分子化合物抑制其Caspase 結(jié)合能力也作為靶向治療的新思路。

本研究中CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示XIAP 抑制劑對(duì)6T-CEM細(xì)胞是具有生長(zhǎng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0.1～100 μmol/L 終濃度的XIAP 抑制劑AT-406都會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，AT-406 聯(lián)合依托泊苷后可明顯增強(qiáng)其生長(zhǎng)抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1 μmol/L 終濃度的XIAP 抑制劑AT-406 和20 nmol/L 的依托泊苷處理6T-CEM 細(xì)胞后Annexin V 陽性細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，聯(lián)合處理組中凋亡率明顯高于依托泊苷單藥組，提示XIAP 抑制劑AT-406 可以增強(qiáng)依托泊苷對(duì)6TCEM 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。XIAP 蛋白的BIR3 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域可以與細(xì)胞凋亡途徑中的起始因子Caspase-9 結(jié)合，從而抑制包括內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡途徑聯(lián)級(jí)反應(yīng)的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程［5］。因此，本研究還通過比色法分析細(xì)胞凋亡途徑聯(lián)級(jí)反應(yīng)下游蛋白Caspase-3 的酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示XIAP 抑制劑AT-406 處理6T-CEM 細(xì)胞后，Caspase-3 的酶活性與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在正常情況下，Caspase-3 在細(xì)胞質(zhì)中的無酶活性，并廣泛分布于各種不同類型的細(xì)胞和組織中，只有在細(xì)胞受到內(nèi)源性或者外源性細(xì)胞凋亡信號(hào)誘導(dǎo)后，并激發(fā)細(xì)胞凋亡途徑聯(lián)級(jí)反應(yīng)。作為Caspase 家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，Caspase-3 被剪切后激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在依托泊苷單藥和聯(lián)合處理組中Caspase-3酶活性明顯上升，聯(lián)合組Caspase-3 酶活性明顯高于依托泊苷單藥組，結(jié)果提示依托泊苷處理將激活細(xì)胞凋亡信號(hào)，XIAP 抑制劑可以增強(qiáng)細(xì)胞凋亡執(zhí)行者Caspase-3 酶活性。本研究通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活化狀態(tài)的Caspase-3，即Cleaved-Caspase-3 在細(xì)胞中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6T-CEM 細(xì)胞經(jīng)XIAP 抑制劑AT-406 處理后，聯(lián)合處理組中Cleaved-Caspase-3 的表達(dá)水平明顯高于依托泊苷單藥組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Caspase-3 酶活性檢測(cè)結(jié)果一致，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明依托泊苷處理可以激活細(xì)胞凋亡途徑，AT-406 可以增強(qiáng)凋亡途徑中Caspase 聯(lián)級(jí)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

綜上所述，XIAP 抑制劑對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病6T-CEM 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，通過抑制XIAP 蛋白并激活依托泊苷誘導(dǎo)的Caspase 酶活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。本研究結(jié)果提示XIAP 抑制劑可作為抗腫瘤藥物增敏劑，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可能為復(fù)發(fā)難治T-ALL 患者的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和新的思路。然而，目前尚未進(jìn)行ALL 動(dòng)物模型的體內(nèi)研究，下一步將建立ALL 小鼠模型，并確定XIAP 抑制劑在體內(nèi)的有效性和安全性。