袁鷹 何平 湯祥瑞 李炯俠 牟建軍

1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬三二〇一醫(yī)院心血管內(nèi)科（陜西漢中723000）；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院（西安710061）

心臟疾病具有高致殘率和高死亡率的特點，嚴(yán)重威脅我國居民的健康，從分子水平探討心肌細(xì)胞的增殖和凋亡可以為心臟治療提供理論依據(jù)［1-2］。燈盞花素（Bregenin，Bre）是從燈盞花植物中分離提取的黃酮類化合物，又稱野黃芩苷（scutellarin，SCU），具有抗炎、抗凝、抗氧化、減少平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖等作用［3］。臨床多用于治療心絞痛、冠心病及急性心肌梗死［4］。有研究結(jié)果表明，燈盞花素可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞I/R 損傷，起到心肌保護(hù)作用［5］。燈盞花素作為一種非競爭性蛋白激酶C（PKC）抑制劑，可通過改善不同性質(zhì)的心臟損傷，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮保護(hù)心肌的作用［6］，但具體機(jī)制尚不明確。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulatedprotein kinases，ERK1/2）通路廣泛參與調(diào)控心肌細(xì)胞的生長、分化與凋亡［7］，燈盞花素對缺氧心肌的保護(hù)作用是否與此有關(guān)，未見相關(guān)報道。因此本實驗觀察燈盞花素對缺氧H9c2心肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制，以期為燈盞花素的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株H9c2 心肌細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究院。

1.2 藥品與試劑燈盞花素，規(guī)格：20 mg，購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone-PIERCE 生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、二甲亞砜（DMSO）、DMEM 培養(yǎng)基購自上海生物工程有限公司；MTT、ERK1/2 抑制劑PD98059 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；鼠單克隆抗體ERK、兔抗鼠p-ERK 抗體、β-actin 抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Gibco 公司生產(chǎn)；Annexinv-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國Epitmics 公司。

1.3 儀器IX73 倒置熒光顯微鏡，德國Eppendorf儀器有限公司生產(chǎn)；BD accuri C6 流式細(xì)胞儀，美國BIO-RAD 公司生產(chǎn)；聚丙烯酰胺垂直電泳、Labwork 凝膠圖像分析系統(tǒng)、Labwork 凝膠圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯光學(xué)有限公司生產(chǎn)；ELX-808 酶標(biāo)儀，美國伯樂公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%FBS 的DMEM 的培養(yǎng)基、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 μg/mL）的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2 心肌細(xì)胞，在37 ℃，飽和濕度，含有5% CO2的培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。每2～3 d培養(yǎng)液更換1 次。當(dāng)H9c2 心肌細(xì)胞生長到對數(shù)期時，以8×104接種到96 孔培養(yǎng)板上，進(jìn)行分組處理培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞凋亡模型的建立及實驗分組恒溫培養(yǎng)24 h 后的H9c2 心肌細(xì)胞分對照組及實驗組（模型組、Bre 低中高劑量組、空白ERK1/2 抑制劑組及Bre 聯(lián)合ERK1/2 抑制劑組），實驗組均采用終濃度為200 μmol/L 的H2O2作用6 h 建立心肌細(xì)胞缺氧模型。

對照組：使用10%的FBS 和DMSO 處理。隨后各實驗組分別做以下處理：模型組（H2O2）：加入終濃度為200 μmol/L 的H2O2；Bre 低劑量組（Bre 20）組：同時加入終濃度為20 μmol/L 的Bre 和200 μmol/L 的H2O2；Bre 中劑量組（Bre 40）組：同時加入終濃度為40 μmol/L 的Bre 和200 μmol/L 的H2O2；Bre 高劑量組（Bre 80 組：同時加入終濃度為80 μmol/L的Bre和200 μmol/L 的H2O2；空白ERK1/2抑制劑組（PD98059）組：終濃度為50 μmol/L 的PD98059 預(yù)處理30 min，再加入終濃度為200 μmol/L 的H2O2；Bre 聯(lián)合ERK1/2 抑制劑組（Bre 80+PD98059）組：終濃度為50 μmol/L 的PD98059 預(yù)處理30 min，同時加入終濃度為80 μmol/L 的Bre和200 μmol/L 的H2O2。

1.4.3 MTT 法檢測細(xì)胞的增殖率取以上不同分組處理培養(yǎng)48 h 后的H9c2 心肌細(xì)胞，參考文獻(xiàn)［8］分別加入MTT 溶液20 μL（5 mg/mL），放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄去上清液，使用PBS 緩沖液洗滌2～3 次，每孔加入150 μL DMSO，室溫下，在恒溫?fù)u床上緩慢震蕩10 min 使結(jié)晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm 波長處檢測各組各孔的吸光度（OD值），每組取5 個平行樣。細(xì)胞增殖率=OD實驗孔/OD對照孔×100%。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞的凋亡率消化、收集以上不同分組處理培養(yǎng)48 h 后的H9c2 心肌細(xì)胞，參考文獻(xiàn)［5］加入AnnexinV-FITC混勻后，再加入1～2 滴PI 染液，充分混勻后，立即采用流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞DNA 含量，即熒光強(qiáng)度值，采用MultiCycle 軟件進(jìn)行分析計算細(xì)胞的凋亡率。

1.4.5 Western blot 法檢測ERK1/2 信號通路的磷酸化水平收集以上不同分組處理培養(yǎng)48 h 后的H9c2 心肌細(xì)胞，使用4 ℃預(yù)冷細(xì)胞裂解液（RIPA：PMSF=94∶6）100 μL 于冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解液在4 ℃下12 000 r/min 離心8 min，取上清，使用BCA 蛋白試劑盒對上清液進(jìn)行蛋白定量，在提取的蛋白質(zhì)中加入5×SDS 凝膠上樣緩沖液混勻，在沸水中煮8 min，使用SDS-PAGE 電泳對目的蛋白進(jìn)行分離，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維（PVDF）膜，5%的脫脂牛奶封閉液封閉2 h 后，加入鼠抗β-tubulin（1∶500）、鼠抗ERK1/2（1：500）、兔抗p-ERK1/2（1∶500）等一抗4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，每次5 min，然后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1 h，再使用PBS 洗膜3 次，每次10 min，用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光顯影法進(jìn)行曝光顯影，使用AlphaImager 2200 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析膠片的光密度值。灰度比值=蛋白條帶灰度/內(nèi)參照蛋白條帶灰度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對H9c2 心肌細(xì)胞增殖的影響與Control 組相比，經(jīng)H2O2處理后的心肌細(xì)胞的增殖率降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但經(jīng)過在20～80 μmol/L Bre 各濃度組的干預(yù)后，明顯促進(jìn)了H9c2 心肌細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加H9c2 心肌細(xì)胞的增殖率升高（P＜0.01）。與H2O2組比較，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的各組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與Bre 各劑量組相比，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的H9c2 心肌細(xì)胞的增殖率顯著下降（P＜0.01）。與Bre 80+PD98059 比較，PD98059 組中的心肌細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 燈盞花素對H9c2 心肌細(xì)胞凋亡的影響與Control 組相比，經(jīng)H2O2處理后的心肌細(xì)胞的凋亡率升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），經(jīng)過在20～80 μmol/L Bre 各濃度組干預(yù)后的H9c2 心肌細(xì)胞的凋亡率隨著濃度的增加降低（P＜0.01）。與H2O2組比較，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的各組心肌細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與Bre 各劑量組比較，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的各組細(xì)胞的凋亡率顯著上升（P＜0.01）。但PD98059 與Bre 80+PD98059 組之間的心肌細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各實驗組對H9c2 心肌細(xì)胞增殖率的影響Tab 1 Effect of each experimental group on the proliferation rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

表1 各實驗組對H9c2 心肌細(xì)胞增殖率的影響Tab 1 Effect of each experimental group on the proliferation rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

注：與對照組比較，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，##P＜0.01；與Bre 20 組比較，ΔΔP＜0.01；與Bre 40 組比較，▲▲P＜0.01；Bre 80組比較，※P＜0.01

分組對照組H2O2模型組Bre 20 Bre 40 Bre 80 Bre 80+PD98059 PD98059例數(shù)6 6 6 6 6 6 6增殖率(%)99.87±0.22 65.37±4.52**73.76±6.23**##81.25±5.16**##ΔΔ 92.52±6.63**##ΔΔ▲▲67.09±3.81**ΔΔ▲▲※※66.82±4.33**ΔΔ▲▲※※

表2 各實驗組對H9c2 心肌細(xì)胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of each experimental group on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

表2 各實驗組對H9c2 心肌細(xì)胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of each experimental group on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

注：與對照組比較，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，##P＜0.01；與Bre 20 組比較，ΔΔP＜0.01；與Bre 40 組比較，▲▲P＜0.01；Bre 80組比較，※P＜0.01

分組對照組H2O2模型組Bre 20 Bre 40 Bre 80 Bre 80+PD98059 PD98059例數(shù)6 6 6 6 6 6 6凋亡率（%）6.26±0.17 72.57±2.12**59.36±2.85**##51.29±2.03**##ΔΔ 30.71±1.39**##ΔΔ▲▲71.22±3.63**##ΔΔ▲▲※※70.56±2.91**ΔΔ▲▲※※

2.3 燈盞花素對H9c2 心肌細(xì)胞中ERK1/2 信號通路的磷酸化水平的影響從實驗結(jié)果看，與Control 組相比，其他各組的p-ERK1/2 蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；與H2O2組比較，Bre 各濃度組中p-ERK1/2 蛋白表達(dá)量均顯著增加（P＜0.01），且隨著濃度的增加p-ERK1/2 蛋白表達(dá)量上升（P＜0.01）。與Bre 各濃度組比較，經(jīng)過ERK1/2抑制劑PD98059 處理后的Bre 80+PD98059、PD98059 兩組細(xì)胞中，p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)被顯著抑制（P＜0.01）。各組間ERK1/2 蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1-3。

圖1 Western blot 檢測H9c2 心肌細(xì)胞ERK1/2 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.1 Western blot analysis of ERK1/2 signaling pathwayrelated protein expression in H9c2 cardiomyocytes

圖2 各實驗組ERK1/2 蛋白的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of ERK1/2 protein in each experimental group

圖3 各實驗組p-ERK1/2 蛋白的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of p-ERK1/2 protein in each experimental group

3 討論

心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅50 歲以上中老年人健康的常見病，約50%的心血管患者生活不能完全自理，我國每年死于心血管疾病的人數(shù)高達(dá)300 萬人，居各種死因首位［9-10］。心肌細(xì)胞的凋亡在各種心臟疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用［11］。目前，關(guān)于心肌細(xì)胞凋亡和增殖的分子機(jī)制是當(dāng)前臨床研究的熱點。

燈盞花素屬于黃酮類化合物，可通過抑制凋亡發(fā)揮對不同類型的心腦損傷的保護(hù)作用［12-13］。研究顯示，燈盞花素可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS 信號通路及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效抑制缺血再灌注大鼠誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［14］。但燈盞花素是否能有效改善缺氧環(huán)境下的心肌細(xì)胞凋亡，未見相關(guān)報道。本研究表明，燈盞花素顯著提高了缺氧H9c2 心肌細(xì)胞的增殖率，并顯著降低了缺氧心肌細(xì)胞的凋亡率，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，結(jié)果提示，燈盞花素能有效促進(jìn)在缺氧環(huán)境中心肌細(xì)胞的增殖，緩解因缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

促有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一組絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，能將細(xì)胞信號傳遞到細(xì)胞核，具有促進(jìn)凋亡與促進(jìn)增殖的雙重調(diào)控作用［15-16］。ERK1/2 是MAPK 家族中的重要亞族之一，在細(xì)胞的生長、分化和增殖等多種病理生理過程中起著重要的調(diào)控作用［17-18］。研究顯示，姜黃素?zé)熕狨タ赡芡ㄟ^下調(diào)p-ERK1/2、CyclinD1 蛋白的表達(dá)而明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖［19］；瓜蔞皮提取物可通過激活ERK1/2 和PI3K/Akt 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻止由H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷而起到保護(hù)作用［20］。在本研究中，燈盞花素顯著上調(diào)了H9c2 缺氧心肌細(xì)胞中p-ERK1/2 的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性，同時經(jīng)過ERK1/2 抑制劑PD98059 的干預(yù)后，其H9c2 缺氧心肌細(xì)胞存活率明顯降低，凋亡率顯著升高，并且p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)量顯著降低。結(jié)果提示，燈盞花素可激活H9c2 缺氧心肌細(xì)胞中ERK1/2 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述，燈盞花素可增加H9c2 缺氧心肌細(xì)胞的增殖，并降低H9c2 缺氧細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與活化ERK1/2 信號通路有關(guān)。