何明霞，劉 靜，楊天偉，許欣景，高 鋒，方藝偉，王文兵，張春霞

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100）

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌Phlebopus portentosus（Berk. & Broome ) Boedijn，俗名黑牛肝菌，隸屬于牛肝菌目Boletales 小牛肝菌科Boletinellaceae，我國主要分布于云南、四川、廣西和海南等地［1-3］，國外分布于泰國和斯里蘭卡，越南、印度尼西亞、巴西、墨西哥、澳大利亞和新西蘭有近似種分布［4-5］。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體品質(zhì)鮮嫩，味道鮮美，肉質(zhì)細膩，營養(yǎng)價值豐富，是珍稀美味食用菌之一［6-7］，其菇房人工栽培及經(jīng)濟果林下仿生栽培都已成功［8］。

菌種質(zhì)量的優(yōu)劣不但直接關(guān)系到食用菌栽培的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至?xí)绊懙缴a(chǎn)的成敗。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種是其人工栽培和仿生栽培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，如何使暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種保持原有的遺傳性狀不變異、不退化，在科研工作和產(chǎn)業(yè)化中都有著重要意義。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌屬于高溫擔(dān)子菌，菌絲對低溫很敏感，在低溫條件下會發(fā)生自溶而死亡，菌絲生長的最適溫度是28～30℃，溫度低于15℃或超過30℃，菌絲生長速度會急劇下降［9］，這也表明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌難以像其他的菌種一樣在0～5℃條件下長期保藏。生產(chǎn)上常用的傳代培養(yǎng)保藏法是將菌種置于15～20℃條件下保藏，每隔3～6 個月轉(zhuǎn)管1 次，這一技術(shù)提供了一個簡便有效的短期保藏方法，但也增加了菌種產(chǎn)生污染和形態(tài)、生理特征發(fā)生變異的風(fēng)險。本試驗研究了不同的菌種保藏方法對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長及出菇的影響，以期篩選出高效、低成本、易操作的保藏方法。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

由收集的野生暗褐網(wǎng)柄牛肝菌分離純化，通過出菇試驗后篩選出的優(yōu)良菌株Cy4［10］，保存于云南省熱帶作物科學(xué)研究所植物保護與微生物利用中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種及菌絲活化培養(yǎng)基

M1 培養(yǎng)基［4］：葡萄糖20.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g、酵母膏2.0 g、馬鈴薯200.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L。 滅菌條件：0.15 MPa，121℃，30 min。

1.2.2 栽培種培養(yǎng)基［8］

橡膠木屑63%（w/w），紅土粉11%（w/w），谷粒25%（w/w），碳酸鈣1%（w/w）。滅菌條件：0.15 MPa，121 ℃，滅菌120 min。

1.3 方法

試驗設(shè)4 個處理：

A.蒸餾水15℃保藏：將暗褐網(wǎng)柄牛肝菌試管種切取約3 mm 大小的菌絲塊，放入裝有5 mL 無菌蒸餾水的試管（150 mm×15 mm）中，每試管接入5 個菌絲塊，置于15℃生化培養(yǎng)箱保藏。

B.蒸餾水室溫保藏：同上，室溫保藏。

C.5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏：在裝有2 mL 5%海藻糖+20%甘油保護劑的凍存管中放入3 個菌絲塊，置于-80℃生化培養(yǎng)箱保藏。

D.斜面種15℃保藏：試管種長滿后，放置于15℃生化培養(yǎng)箱中保藏。

1.3.1 菌絲培養(yǎng)

菌種保藏12 個月后，挑取各處理菌絲塊接種于M1 培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)接活化后，用6.5 mm 打孔器打孔，然后挑取菌塊接入M1 試管培養(yǎng)基（試管為200 mm×25 mm），每試管3 個接種塊，每個處理5次重復(fù)。28℃恒溫暗光培養(yǎng)，觀察記錄菌絲萌發(fā)時間、菌落顏色、有無菌核、菌絲長勢，菌絲長滿試管時間。超低溫保藏菌種的解凍方法為先從-80℃超低溫冰箱取出，放入37℃水浴鍋里解凍，解凍后用滅菌濾紙將菌絲塊吸干。

1.3.2 栽培出菇

將長滿試管的供試菌種接種于液體M1 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種6.5 mm 的菌餅30 個，靜置一晚后，于28℃恒溫、暗光、130 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，然后將液體菌種接到裝有栽培基質(zhì)的菌袋里，置于28～30℃暗光培養(yǎng)，每處理接種60 袋。記錄菌絲滿袋時間，觀察菌絲長勢，待菌絲長滿菌袋，覆土移入出菇房培養(yǎng)，記錄出菇時間、子實體成熟袋數(shù)、單菇重。

1.3.3 試驗數(shù)據(jù)處理

數(shù) 據(jù) 以“ 平 均 值± 標 準 差”表 示。 應(yīng) 用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件處理，采用one-way ANOVA（LSD）進行試驗數(shù)據(jù)方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保藏方法對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長的影響

由表1 可知，4 種不同保藏方法的菌絲萌發(fā)時間有差異。蒸餾水15℃保藏，菌絲萌發(fā)所需時間最短，為（4.20±0.28）d，菌落黃褐色，菌絲粗壯、致密；菌絲萌發(fā)所需時間最長的是蒸餾水室溫保藏，為（6.50±0.89）d，菌落灰黃色，菌絲較濃密。4 種不同保藏方法都能產(chǎn)生暗褐色的菌核。蒸餾水15℃保藏，菌絲長滿試管時間最短（13.50±2.13）d，長滿試管時間最長的是蒸餾水室溫保藏，需（18.50±2.60）d，二者差異顯著（P＜0.05）。

表1 不同保藏方法對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長的影響

2.2 不同保藏方法對栽培種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長的影響

由表2 可知，4 種不同保藏方法的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲在培養(yǎng)料中生長有較大的差異。蒸餾水15℃保藏與其它3 種處理差異顯著，菌絲長滿菌袋的時間最短（27.14±1.57）d，菌絲濃密、粗壯，菌核數(shù)量多；其次為斜面種15℃保藏，菌絲長滿菌袋的時間（31.14±0.90）d，5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏和蒸餾水室溫保藏，菌絲長滿菌袋需（33.14±0.90）d 和（33.71±1.70）d。

2.3 不同保藏方法對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇的影響

從表3 可知，蒸餾水15℃保藏、5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏，覆土后出菇時間較短，僅需（13.86±1.08）d、（14.29±0.76）d，與其它2 種保藏方法差異顯著（P＜0.05）；蒸餾水15℃保藏、5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏，子實體成熟率分別達到98.50%、92.40%，其他2 種保藏方法子實體成熟率分別為55.70%、62.80%。子實體平均單菇最重的是蒸餾水15℃保藏，重量為（94.54±1.26）g，與其他3 種保藏方法差異顯著（P＜0.05）。蒸餾水室溫保藏子實體重量最輕，僅為（68.57±2.16）g。

3 結(jié)論與討論

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌屬于高溫食用菌，菌絲最適生長溫度為28～30℃，低于15℃時菌絲生長受到抑制。李希政等［11］采用4℃冰箱冷藏和室內(nèi)常溫兩種方式保存黑牛肝菌菌種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4℃冰箱冷藏6 個月后的黑牛肝菌菌絲成活率僅為15%，轉(zhuǎn)管成活率極低；而室內(nèi)常溫保存的菌種，成活率為94%，菌絲老化失活現(xiàn)象較少，因此，黑牛肝菌菌種保藏建議采用室內(nèi)常溫保存方法；但對于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種長期保存，單純的室內(nèi)常溫保存方法并非最佳選擇。

本文通過研究不同保護劑、溫度等條件對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種長期保藏效果的影響，結(jié)果顯示：蒸餾水15℃是暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種長期保藏的最佳方法，保藏12 個月后，菌絲萌發(fā)快，只需（4.20±0.28）d，菌絲黃褐色、致密、粗壯；菌絲長滿試管時間短，為（13.50±2.13）d；栽培菌袋菌絲滿袋時間短（27.14±1.57）d，覆土后（13.86±1.08）d 就可出菇，子實體平均單菇重（94.54±1.26）g。

菌種保藏是食用菌栽培生產(chǎn)的重要工作之一，不同的食用菌需尋找適宜的菌種保藏方法。Karaduman 等［12］研究發(fā) 現(xiàn)，20℃是裂 褶菌較好的短期保藏溫度。張丹等［13］通過正交實驗分析出適宜金針菇菌種中短期保存的方法，認為溫度是金針菇菌種保藏的重要影響因子，20℃是短期（1～6 個月）菌種保藏的最佳方式，當(dāng)菌種保藏時間需超過6 個月時，應(yīng)采用-80℃低溫保藏；另外發(fā)現(xiàn)甘油、海藻糖、甘露醇均有利于金針菇菌種的中短期保藏，與本研究中采用5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種的效果僅次于蒸餾水15℃保藏的結(jié)果一致。