姜 艷，高 燕，李桂琳，李澤生，周侯光，羅 凱

（云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南瑞麗678600）

紫菀石斛（Dendrobium transparens）是一種喜陰涼的多年生蘭科石斛屬（Dendrobium）草本植物，原產(chǎn)于緬甸、印度海拔1 500 m 的山中，花色素麗，玲瓏可愛，花姿優(yōu)雅，株型優(yōu)美，具有很高的觀賞價值。楊曉娜等［1］研究結(jié)果表明，紫菀石斛具有相當(dāng)高的營養(yǎng)價值。近年來隨著生活水平的不斷提高，人們對紫菀石斛的需求量不斷增大，野生紫菀石斛資源產(chǎn)出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上需求，人工栽培紫菀石斛便應(yīng)運而生。目前紫菀石斛種苗繁殖主要是靠收集野生資源進(jìn)行分株繁殖，增殖系數(shù)低，原材料浪費大；加之過度采挖，紫菀石斛野生資源日益枯竭。隨著紫菀石斛生產(chǎn)種植規(guī)模的擴大，分株繁殖已不能滿足市場對種苗的需求。近十多年來，隨著植物組培技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)需要，很多植物常利用組培快繁種苗，文心蘭、蝴蝶蘭、鐵皮石斛、鼓槌石斛等蘭科植物已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)［2-5］。為了探索紫菀石斛組培育苗的最佳途徑，筆者于2017-2018 年對從緬甸引進(jìn)的紫菀石斛野生蒴果種子開展無菌播種、原球莖誘導(dǎo)、增殖分化、壯苗生根、假植育苗和移栽技術(shù)試驗研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫菀石斛從緬甸引進(jìn)，栽培于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所石斛資源圃。選擇無病害、生長健壯植株上所結(jié)的發(fā)育正常、飽滿成熟、未開裂的蒴果為外植體。

1.2 方法

1.2.1 無菌播種

蒴果用0.1%洗潔精或洗衣粉洗凈，純凈水沖洗2～3 次，置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 s，10%次氯酸鈉溶液消毒15～20 min，無菌水清洗5～6 次，用無菌濾紙吸干表面水分，酒精燈烘烤外植體表面至干燥。切開蒴果，將種子均勻播種在5 種不同萌發(fā)培養(yǎng)基：A1）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L，A2）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥5 g/L，A3）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+香蕉泥5%，A4）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L +6-BA 0.1 mg/L，A5）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+NAA 0.1 mg/L，每個處理接種5 瓶，先暗培養(yǎng)5 d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH 為5.8，培養(yǎng)溫度為22～25℃，光照強度為1 600～2 000 lx，光照時間8～10 h/d。培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.2.2 繼代增殖分化培養(yǎng)

將種子萌發(fā)形成的小芽接種于繼代增殖分化培養(yǎng)，以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥30 g/L 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.1、0.2、0.4 mg/L）或NAA（0.1、0.2、0.4 mg/L），共6 種培養(yǎng)基（B1-B6 處理），每種培養(yǎng)基接種10 瓶，每瓶接種10 株。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 200 Lx，光照時間10～12 h/d。培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計增殖倍數(shù)及生長狀況。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng)

將叢生芽分割成單芽，選取株高在3 cm 以上的單芽接種于不同壯苗生根培養(yǎng)基，以3/4 MS+蔗糖20 g/L+瓊脂5.0 g/L+NAA 0.5 mg/L 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的馬鈴薯泥和香蕉泥：C1）香蕉泥100 g/L，C2）香蕉泥70 g/L+馬鈴薯泥30 g/L，C3）馬鈴薯泥100 g/L，C4）香蕉泥50 g/L+馬鈴薯泥50 g/L，共4 種培養(yǎng)基（C1-C4 處理），每種培養(yǎng)基接種10 瓶，每瓶接種10 株。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 200 lx，光照時間10～12 h/d。培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計生根率及生長狀況。

1.2.4 煉苗

選取生長一致、株高4～6 cm、根系3 cm 以上的瓶苗，分別置于蔭蔽度70%～80%的塑料大棚苗床上煉苗5、10、20、30 d，共4 個處理（D1-D4)，每個處理50 瓶。棚內(nèi)通風(fēng)透氣，無漏雨，控制溫濕度。按照統(tǒng)一流程移栽，觀察不同煉苗時間的移栽成活率及生長狀況。

1.2.5 移栽

將株高5 cm 以上、煉苗20 d 的生根苗取出，用清水洗干凈根部的培養(yǎng)基，在50%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍溶液中浸泡10 min，撈出放入透氣的容器內(nèi)，均勻攤開，晾干至根部發(fā)白，分別移栽至4 種不同的基質(zhì)：E1）刨花，E2）樹皮，E3）樹皮屑/刨花體積比=1/1，E4）樹皮屑/水苔體積比=2/1，3 株/叢，株行距5 cm×5 cm。蔭蔽度70%～80%，濕度60%～70%，溫度控制26～30℃。移栽60 d后統(tǒng)計成活率及生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對紫菀石斛種胚萌發(fā)率的影響

無菌播種12～18 d 后，種子慢慢吸水膨大，由金黃色變成綠色，40 d 后從種胚誘導(dǎo)出大量的原球莖，50 d 后原球莖萌發(fā)出綠色芽尖（圖1）。紫菀石斛種胚在不同的培養(yǎng)基中都能萌發(fā)，由表1可以看出，以A2 處理（1/2 MS +蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥5 g/L 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率最高（95%），萌發(fā)時間最快（12 d），原球莖粗壯，呈綠色；A3 處理（1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+香蕉泥5 g/L 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率較高（90%），萌發(fā)時間和萌發(fā)狀況與A2 處理近似；A4 和A5 處理（1/2 MS+6-BA 0.1 mg/L 和1/2 MS+NAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率較低，分別為87%、85%，萌發(fā)時間較長（15～16 d），原球莖較細(xì)弱，淺綠色；A1 處理（1/2 MS 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率最低（80%），原球莖細(xì)弱，黃綠色。

表1 不同培養(yǎng)基配方對紫菀石斛種胚萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)的影響

2.2 不同激素濃度對紫菀石斛繼代增殖分化的影響

將種胚萌發(fā)分化的幼芽接種于添加不同激素濃度的培養(yǎng)基中，15 d 后幼苗開始分化出小芽，小芽不斷分蘗長出叢生芽。結(jié)果（表2）顯示，6種增殖分化培養(yǎng)基中，以B2 處理（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+6-BA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基）增殖分化效果最好，增殖倍數(shù)最高，為10.2 倍，分化的小苗整齊均勻，在培養(yǎng)基上長出密集的小苗，葉片大、深綠色、生長粗壯；當(dāng)6-BA 濃度為0.4 mg/L 時，增殖倍數(shù)呈下降趨勢，分化的小苗葉片細(xì)長，再分化能力變?nèi)?；B5 處理（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基）增殖分化效果好，增殖倍數(shù)最高（9.8 倍），當(dāng)NAA 濃度為0.4 mg/L 時，小苗根系發(fā)達(dá)，但葉片細(xì)小，生長緩慢，增殖倍數(shù)下降。

表2 不同激素濃度對紫菀石斛繼代增殖分化的影響

2.3 不同添加物對紫菀石斛壯苗生根的影響

將繼代增殖培養(yǎng)長至3 cm 以上的幼苗接種于不同添加物濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)的結(jié)果見表3 和圖2。從中可以看出，4 種生根培養(yǎng)基中，以C2 處理（3/4 MS+蔗糖20 g/L+瓊脂5.0 g/L+NAA 0.5 mg/L+馬鈴薯泥30 g/L+香蕉泥70 g/L 培養(yǎng)基）誘導(dǎo)生根效果最好，平均株高6.7 cm，平均根數(shù)5.5 條，平均根長5.2 cm，生根苗粗壯，葉片舒展，根系多而粗壯；其次為C1 添加香蕉泥100 g/L 培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根較好，平均株高5.8 cm，平均根數(shù)5.3 條，平均根長4.9 cm，生根苗健壯，葉片深綠色；添加馬鈴薯泥100 g/L 的C3 培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根較差，平均株高4.9 cm，平均根數(shù)3.4 條，平均根長3.1 cm，生根苗細(xì)弱，葉片短小，根系少而細(xì)弱。說明香蕉泥和馬鈴薯泥濃度合理組配對紫菀石斛生根有顯著的促進(jìn)作用，且對幼苗的生長有一定促進(jìn)作用。

表3 不同添加物對紫菀石斛壯苗生根的影響

2.4 不同煉苗天數(shù)對紫菀石斛移栽成活的影響

從表4 可以看出，瓶苗的污染率隨著煉苗天數(shù)的增加而增加，而成活率呈拋物線分布。D3 處理（煉苗20 d）為最好，污染率低（4%），成活率最高（95%），瓶苗生勢好，無黃葉，無黑色根；煉苗＜10 d，雖然污染率低，但成活率低于85%；煉苗30 d，污染率高達(dá)8%，成活率降至93%。

表4 不同煉苗天數(shù)對紫菀石斛移栽成活的影響

2.5 不同基質(zhì)對紫菀石斛移栽成活的影響

紫菀石斛生根瓶苗在自然光下煉苗20 d 后，葉色轉(zhuǎn)深綠色，葉片厚大、舒展，莖基部轉(zhuǎn)深綠色、粗壯，白色根增多、粗壯。從表5 可以看出，以E3 處理苗的長勢最好，苗床下層鋪厚度4 cm 樹皮屑（大小2～3 cm），上層鋪厚度4 cm 刨花，透氣、瀝水，保濕效果好，移栽成活率達(dá)96%，生長抽芽快；E4 處理表現(xiàn)也不錯，樹皮屑間隙大，難以操作，樹皮屑上鋪一層水苔，濕度控制不好，根基部易腐爛，生長抽芽慢；E1 處理腐熟消毒不徹底，透氣、瀝水性較差，移栽后刨花易長霉菌而板結(jié)，水肥吸收困難，成活率低（87%），但刨花成本低廉。

表5 不同基質(zhì)對紫菀石斛移栽成活的影響

3 結(jié)論

通過試驗研究，篩選出最適宜紫菀石斛種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥5 g/L，萌發(fā)率達(dá)95%；增殖分化培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+6-BA 0.2 mg/L，增殖倍數(shù)達(dá)10.2 倍；壯苗生根培養(yǎng)基為3/4 MS+蔗糖20 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥30 g/L+香蕉泥70 g/L+NAA 0.5 mg/L，生根率達(dá)100%，苗壯、株高、根系多而粗壯，生長好。

不同培養(yǎng)階段添加天然有機物對紫菀石斛種子的種胚萌發(fā)生長有促進(jìn)作用。種子萌發(fā)時，原球莖在1/2 MS 基本母液中添加馬鈴薯泥5%的培養(yǎng)基中生長好，說明馬鈴薯對原球莖增殖分化有促進(jìn)作用，該試驗結(jié)果與高燕等［6］的研究結(jié)果相符合。無菌播種獲得的原球莖如不及時轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基中，會很快分化成小苗慢慢變黃，影響分化率。在顯微鏡下觀察，紫菀石斛種子的種胚比白芨種子種胚小，積累的營養(yǎng)成分要少，紫菀石斛種子萌發(fā)誘導(dǎo)原球莖再進(jìn)行增殖分化，這與李守嶺等［7］報道相同。因此，在紫菀石斛組培快繁過程中，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的天然有機物對紫菀石斛種子萌發(fā)、出苗情況也不同，其中以馬鈴薯增殖分化效果最佳，馬鈴薯和香蕉合理組配對壯苗生根效果最佳，這與高燕等［8］報道相同。

不同的煉苗天數(shù)對幼苗移栽成活率影響較大，以煉苗20 d 最適宜，移栽后幼苗葉片厚大、深綠色有光澤，莖生長粗壯呈深綠色，成活率最高（95%）；煉苗＜10 d，葉片綠色，但葉片不夠厚實，移栽成活率較低；煉苗＞30 d，污染率增加，瓶內(nèi)養(yǎng)分降低，黃葉增多，移栽成活率下降。

移栽基質(zhì)以下層透氣、瀝水性好（樹皮屑）與上層腐熟消毒（刨花）的組合最好，下粗上細(xì)的保水、透氣性適于叢生芽的抽芽生長，保肥、保水性好，移栽成活率最高（96%）。樹皮屑和水苔雖然瀝水性好，但高溫高濕季節(jié)的濕度若控制不好，易引起根基部腐爛，移栽成活率下降。