張新新，趙玉龍，朱秀同，劉浩，趙麗霞，柳珊，吳雅清，李衛(wèi)東，何平有

（瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司 河北保定 071000）

雞傳染性支氣管炎?。↖nfectious bronchitis，IB），是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高密度接觸性傳染疾病，各日齡的雞均易感，其感染的主要特征是氣管啰音、咳嗽和打噴嚏。IBV 還可以侵害雞的腎臟、輸卵管和腸道等組織器官，造成感染雞發(fā)生腎炎或產(chǎn)蛋母雞的產(chǎn)蛋量及蛋品質(zhì)的下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

IBV 的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約27.6kb，該病毒基因組具有獨特的轉(zhuǎn)錄合成機(jī)制，再加上自然進(jìn)化、多株免疫和高密度飼養(yǎng)等客觀因素造成野毒和疫苗毒大量長期共存，使得IBV 極容易發(fā)生點突變、基因缺失、插入以及基因重組等，進(jìn)而導(dǎo)致IBV 不斷產(chǎn)生變異，新的血清型和基因型不斷出現(xiàn)[2]。

目前國際上尚缺乏統(tǒng)一的IBV 分類方法，現(xiàn)有的IBV 分型方法主要為基于病毒中和實驗（virus neutralisation test，VNT）的血清學(xué)分型方法和基于S1 基因序列的基因分型方法。迄今為止已有大量的S1 基因序列登錄在GenBank 中，且大部分的研究結(jié)構(gòu)均顯示出基因分型與血清學(xué)分型結(jié)果之間具有高度一致性，又由于VNT 所需的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清缺乏公認(rèn)的權(quán)威機(jī)構(gòu)，使得血清學(xué)分型方法在實際應(yīng)用中越來越顯示出局限性，因而基因分型成為當(dāng)前最主流的分型方法。本文通過對IBV 分離株S1 基因的測序分析，對市場免疫失敗的雞只進(jìn)行了毒株確定，確定病毒為野毒感染，而非來源于疫苗毒。

1 材料與方法

1.1 樣品

徐州某雞場疑似感染IBV 的病料，主要為氣管、脾和肺。市場上購買的某A、B 兩廠家的IB 活疫苗。

1.2 主要試劑

DNA/RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RT-PCR 一步法試劑盒、T4 連接酶、DL2000 DNA Marker、6×Loading Buffer 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 IBV S1 基因的RT-PCR

將病料剪成小塊，加入適量滅菌的生理鹽水進(jìn)行充分研磨，反復(fù)凍融3 次后，4,000r/min 離心10min 后取上清液用于RNA 的抽提。參照GenBank 上公布的IBV 全基因組序列，使用Premier 5.0設(shè)計一對通用引物，目的片段包含IBV 完整S1 基因，長約1700bp，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：

IBV-S1 F：5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′，

IBV-S1 R：5′CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′；

反應(yīng)體系為：10×Buffer 1μL，MgCl22μL，dNTP Mixture 1μL，RNaseInhibitor0.2μL，AMV RTaseXL 0.2μL，AMV-Optimized Taq 0.2μL，IBV-S1 F 0.4μL，IBV-S1 R 0.4μL，Total RNA 1.4μL，RNase-free Water 3.2μL。反應(yīng)程序為：50℃30min；95℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30 個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

1.4 IBV S1 基因的克隆測序及分析

將上述RT-PCR 產(chǎn)物電泳后進(jìn)行切膠回收，將純化產(chǎn)物插入到克隆載體pMD18-T simple 中，再轉(zhuǎn)入Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)繁，菌液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將鑒定含有重組質(zhì)粒的菌液送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 結(jié)果

IBV S1 基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示，病料與A、B 兩種疫苗中均有約1,700bp 長的目的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期片段大小一致，如圖1。

圖1 IBV S1 基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 S1 基因測序結(jié)果

將陽性重組質(zhì)粒的測序結(jié)果經(jīng)過序列拼接比對后，發(fā)現(xiàn)A、B 兩種疫苗株的S1 基因完全相同（標(biāo)記為#123），與病料中的分離株（標(biāo)記為#0）進(jìn)行同源比對，在S1 基因的283 位有堿基差異，疫苗株為堿基G，病料中的分離株為堿基T，其余序列均相同，如圖2。

圖2 序列比對結(jié)果

4 討論

IBV 793/B 型又稱為4/91 型和CR88 型，源于歐洲，侵害雞只的呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及腎臟，給歐洲的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。Cavanagh 等報道在793/B 野毒株致弱為疫苗毒株的過程中，S1基因出現(xiàn)了一個核苷酸突變283T→G，導(dǎo)致S 蛋白發(fā)生一個氨基酸替換95S→A，這可以作為793/B 型分離株來源于野毒或疫苗毒的一個依據(jù)[3]。在我國，793/B 型IBV 的流行還尚存爭議，我國農(nóng)業(yè)部也未批準(zhǔn)使用793/B 疫苗，但是793/B 疫苗卻在臨床上已有使用。由于IBV 病毒除了自身因基因組內(nèi)發(fā)生點突變、缺失和插入而發(fā)生突變形成變異株甚至新的血清型病毒外，該病毒還可以與其他毒株在同時感染一個細(xì)胞時發(fā)生基因重組而形成新的病毒[4]，因此應(yīng)慎重選用793/B 疫苗，并且有必要通過持續(xù)監(jiān)測對類793/B毒株的流行趨勢和風(fēng)險進(jìn)行必要的評估。

S1 蛋白是IBV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有重要的生物學(xué)功能，S1蛋白含有與病毒中和、血凝抑制抗體、血清型特異性、細(xì)胞吸附性、組織親和性及毒力相關(guān)的抗原位點，也是IBV 中變異最大的蛋白，因此S1 基因是IBV 研究的重點。多數(shù)學(xué)者也是針對于S1 基因序列對IBV 進(jìn)行基因分型的。

5 結(jié)論

本文中對可疑IBV CR88 型疑似病料進(jìn)行了RT-PCR，并與疫苗株進(jìn)行了序列比對，確定該病料中毒株為793/B 野毒，而非疫苗毒株。