孟 君，陸建良，孫 勇，周 青，嚴(yán)士海

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院，江蘇 連云港 222001； 2. 江蘇省中醫(yī)院，南京 210029)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是指結(jié)腸傳輸功能障礙，腸內(nèi)容物傳輸緩慢引起的便秘，其癥狀主要表現(xiàn)為大便次數(shù)減少、少便意或便意消失、糞質(zhì)堅(jiān)硬，一般伴有腹脹，其病因不清，癥狀頑固[1]。由于現(xiàn)代社會(huì)節(jié)奏加快，人們的精神壓力增大，飲食和生活習(xí)慣的改變，使得慢傳輸型便秘的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前慢傳輸型便秘還是以西藥治療為主，但是患者需要長(zhǎng)期用藥，所以會(huì)帶來(lái)很多不良反應(yīng)，如電解質(zhì)紊亂、胃腸功能障礙以及心血管事件等，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療便秘歷史悠久、療效顯著、不良反應(yīng)少而輕，但其具體作用機(jī)制不明。

朱氏潤(rùn)腸方是我國(guó)首批老中醫(yī)藥專家?guī)煶兄笇?dǎo)老師朱秉宜教授的經(jīng)驗(yàn)方。他提出“清”“潤(rùn)”兩法，“以清代通、以潤(rùn)代瀉”，清熱潤(rùn)腸，滋陰增液，并研制出朱氏潤(rùn)腸方。本研究擬復(fù)制慢傳輸型便秘大鼠模型，觀察朱氏潤(rùn)腸方的改善作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

成年健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(220±20) g，由南通大學(xué)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK (蘇)2014-0001)。

1.2 藥物與試劑

大黃和朱氏潤(rùn)腸方均由連云港市中醫(yī)院制劑部提供。朱氏潤(rùn)腸方組成：玄參、麥冬、生地黃、火麻仁、杏仁、全栝樓、生白術(shù)各20 g，升麻15 g，枳殼15 g，由連云港市中醫(yī)院制劑部按照2010年版藥典要求制備成水煎劑，約含生藥量2 g/ml。根據(jù)文獻(xiàn)[3]計(jì)算出中藥人鼠等效劑量為朱氏潤(rùn)腸方低劑量(28.8 g/kg)，臨床等效劑量的2倍為朱氏潤(rùn)腸方高劑量(57.6 g/kg)；枸櫞酸莫沙必利片， 成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(批號(hào)150413)；PI3K、p-PI3K、akt、p-akt抗體、GAPDH一抗(美國(guó) Cell Signaling 公司)；ECL顯色試劑盒、彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Thermo公司)；PVDF膜(Millipore公司)；DAPI：凱基生物；Anti-AQP3抗體、Anti-AQP8抗體(Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H1650R)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9022)；上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；顯微鏡CX31，日本 OLYMPUS；石蠟包埋機(jī)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；石蠟超薄切片機(jī) Leica 德國(guó)；ABI7500 Real-time PCR定量?jī)x，美國(guó)ABI公司；Western SDS-Page 電泳儀，美國(guó)BIORAD公司。

2 方法

2.1 大鼠造模與給藥

將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、朱氏潤(rùn)腸方高劑量組、朱氏潤(rùn)腸方低劑量組和莫沙必利組每組各10只。根據(jù)文獻(xiàn)[4]采用大黃致瀉結(jié)腸法造模，除正常組外其余大鼠按150 mg/kg/d給予大黃懸濁液灌胃，隨后灌胃劑量以150 mg/kg/d遞增，直到50%大鼠出現(xiàn)腹瀉，維持該劑量直到80%的大鼠稀便消失，再以150 mg/kg/d遞增，直到50%大鼠出現(xiàn)腹瀉并維持劑量至80%大鼠便秘，然后再加量，如此循環(huán)直到第3次出現(xiàn)80%的大鼠稀便消失，維持該劑量繼續(xù)灌胃1周，發(fā)現(xiàn)大鼠毛發(fā)枯燥，易激怒，糞便量明顯減少，質(zhì)地偏硬，糞便含水量明顯降低，表明慢傳輸型便秘模型復(fù)制成功。造模成功后第1天起給予相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，朱氏潤(rùn)腸方高劑量組、低劑量組和莫沙必利組大鼠分別以57.6 g/kg、28.8 g/kg和2.5 mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)15 d，正常組和模型組大鼠給予等量生理鹽水。

2.2 測(cè)定24 h糞便總量與糞便含水量

收集造模后和治療后各組大鼠24 h糞便總量，記錄顆粒數(shù)并稱濕重(A)，將糞便放入干燥箱中干燥3 h，稱干重(B)，計(jì)算糞便含水量=(A-B)/A×100%。

2.3 活性炭懸液推進(jìn)法測(cè)定大鼠腸道傳輸功能

在末次給藥后禁食不禁水12 h，分別經(jīng)口灌入印度墨汁2 ml，30 min后頸椎脫臼法處死，剖腹取出幽門到直腸末端全部腸道，在無(wú)張力狀態(tài)下測(cè)量腸道全長(zhǎng)及墨汁在腸道的推進(jìn)距離，計(jì)算墨汁推進(jìn)距離占腸道全長(zhǎng)的百分比并進(jìn)行結(jié)果比較。碳末推進(jìn)百分率(%)=(碳末推進(jìn)長(zhǎng)度/腸道全長(zhǎng))×100。

2.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP8表達(dá)

取各組大鼠距肛門11 cm處結(jié)腸1 cm，用生理鹽水沖洗干凈后放入4%的多聚甲醛中固定。石蠟包埋并切片，脫蠟水化，抗原修復(fù)；切片放入3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉，每張切片加入50 μL稀釋的一抗覆蓋組織，4 ℃過夜； PBS沖洗加二抗，4 ℃孵育50 min；PBS沖洗加DAB溶液，蘇木素復(fù)染，然后50%、70%、80%、90%、100%乙醇浸泡脫水，二甲苯1，2浸泡幾分鐘晾干，滴加中性樹膠封片，干燥后置于顯微鏡觀察。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)大鼠AQP3、AQP8 mRNA表達(dá)

采用Trizol-離心柱法提取大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA純度，計(jì)算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量：A260/A280>1.8且<2.0，則可以滿足后續(xù)RT-qPCR所需。引物由南京拜睿生物科技有限公司合成，引物序列：AQP3：上游5’ CAAGCTGCCCATCTACAC 3’，下游5’ AAAGAAGCCATTGACCATAT 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度189 bp；AQP8：上游5’ TCATTGGGTGTCTATCGG 3’，下游5’ AATTAGCAGCATGGTCTTG 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度184 bp。內(nèi)參GAPDH:上游5’AGGTCGGTGTGAACGGATTTG3’，下游5’TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp。AQP3、AQP8及GAPDH的PCR參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性30 s，進(jìn)入PCR循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠結(jié)腸AQP3及AQP8表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照，與目的產(chǎn)物進(jìn)行比較。

2.6 Western Blotting法檢測(cè)大鼠結(jié)腸PI3K、akt的表達(dá)

將各組大鼠結(jié)腸組織液氮研磨提取蛋白，采用 BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，電泳后的膠體經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟，孵上PI3K、p-PI3K、akt、p-akt、GAPDH一抗，放在冰箱中的搖床上 4 ℃過夜 12 h 后取出，PBS 沖洗 3 次，孵上二抗，常溫下?lián)u 1 h 后將膜取出，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光，采用ImagePro Plus 6.0軟件將掃描后的圖像進(jìn)行灰度分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對(duì)STC大鼠糞便的影響

表1示，采用大黃灌胃之后，各造模組大鼠24 h糞便總量明顯減少，糞便含水量也明顯降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)過相應(yīng)藥物干預(yù)之后，各治療組大鼠情況均有所好轉(zhuǎn)，朱氏潤(rùn)腸方高、低劑量組和莫沙必利組大鼠24 h糞便總量增加，質(zhì)地變軟，含水量明顯增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。提示朱氏潤(rùn)腸方能增加STC大鼠的糞便總量與含水量，改善便秘癥狀。

3.2 對(duì)STC大鼠腸道傳輸功能的影響

表2示，與正常組比較，STC造模組大鼠碳末推進(jìn)率明顯降低(P<0.01)，而各治療組大鼠的碳末推進(jìn)率均明顯提高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示朱氏潤(rùn)腸方能增強(qiáng)STC大鼠腸道傳輸功能。

表2 朱氏潤(rùn)腸方對(duì)STC大鼠腸道傳輸功能的影響

3.3 對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP8表達(dá)的影響

圖1示，AQP3和AQP8陽(yáng)性細(xì)胞均為棕黃色，與正常組比較，STC造模組大鼠結(jié)腸黏膜AQP3和AQP8陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)過相應(yīng)藥物干預(yù)，各治療組大鼠黏膜呈淺棕黃色表達(dá)，朱氏潤(rùn)腸方高、低劑量組均能明顯減少AQP3和AQP8陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。提示朱氏潤(rùn)腸方能降低STC大鼠AQP3和AQP8的表達(dá)，治療便秘。

3.4 對(duì)大鼠結(jié)腸AQP3、AQP8 mRNA表達(dá)的影響

圖1 朱氏潤(rùn)腸方對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP8表達(dá)的影響(免疫組化，×400)

表3示，與正常組比較，STC造模組大鼠結(jié)腸AQP3和AQP8 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；而經(jīng)過相應(yīng)藥物干預(yù)之后，各治療組大鼠AQP3和AQP8 mRNA的表達(dá)明顯降低，朱氏潤(rùn)腸方高劑量組降低尤其明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與免疫組化的結(jié)果類似。提示AQP3和AQP8表達(dá)升高可能是導(dǎo)致慢傳輸型便秘的病理機(jī)制之一，而朱氏潤(rùn)腸方可能通過降低AQP3和AQP8的表達(dá)來(lái)改善慢傳輸型便秘。

3.4 對(duì)大鼠結(jié)腸PI3K、akt表達(dá)的影響

圖2表4示，Western Blot結(jié)果顯示，各組大鼠結(jié)腸PI3K、akt的表達(dá)差異不大(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸p-PI3K、p-akt的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；而經(jīng)過相應(yīng)藥物干預(yù)之后，各治療組大鼠p-PI3K、p-akt的表達(dá)明顯降低，朱氏潤(rùn)腸方高劑量組降低最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示PI3K/akt信號(hào)通路激活可能在慢傳輸型便秘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而朱氏潤(rùn)腸方通過抑制該通路的磷酸化來(lái)改善慢傳輸型便秘。

表3 朱氏潤(rùn)腸方對(duì)大鼠結(jié)腸AQP3、AQP8 mRNA表達(dá)的影響

注：圖中1-5分別代表正常組、模型組、朱氏潤(rùn)腸方高劑量組、朱氏潤(rùn)腸方低劑量組與莫沙必利組圖2 朱氏潤(rùn)腸方對(duì)大鼠結(jié)腸PI3K/akt表達(dá)的影響

4 討論

慢傳輸型便秘是一種臨床常見疾病，尤其是中老年人居多，患者主要表現(xiàn)為大便秘結(jié)、排便次數(shù)減少、腹脹等，還會(huì)引起一些心理疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。但是，目前慢傳輸型便秘的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。中醫(yī)認(rèn)為慢傳輸型便秘病變部位主要在大腸，其病機(jī)主要表現(xiàn)為氣虛、陰虛兩方面[5]，導(dǎo)致腸道干澀不潤(rùn)、腑氣滯留不下。朱氏潤(rùn)腸方是朱秉宜的經(jīng)驗(yàn)方，該方健脾益腎補(bǔ)其氣血，增液潤(rùn)腸，行氣導(dǎo)滯[6]，從而療效顯著，得到患者的肯定，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在觀察其療效，探討其機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用大黃灌胃復(fù)制慢傳輸型便秘模型，觀察大鼠的一般體征，如毛發(fā)枯燥，活動(dòng)減少，飲食量減少，大便量少而干燥，與臨床STC患者癥狀類似。采用活性炭懸液推進(jìn)法測(cè)定大鼠的腸道傳輸功能，發(fā)現(xiàn)腸道碳末推進(jìn)率明顯降低。經(jīng)過相應(yīng)藥物干預(yù)之后，證實(shí)朱氏潤(rùn)腸方可以增加大鼠的糞便總量和糞便含水量，提高大鼠腸道碳末推進(jìn)率，改善慢傳輸型便秘癥狀。

表4 朱氏潤(rùn)腸方對(duì)大鼠結(jié)腸PI3K/akt表達(dá)的影響

隨著近年來(lái)病理生理學(xué)以及分子生物學(xué)的快速發(fā)展，慢傳輸型便秘已被證實(shí)與腸道水通道蛋白(AQPs)密切相關(guān)。AQPs屬通道蛋白MIP家族成員，是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)(內(nèi)在膜蛋白)，在細(xì)胞膜上組成“孔道”，通過調(diào)整生物膜的透水性，介導(dǎo)水由低滲區(qū)向高滲區(qū)移動(dòng)，參與水的分泌、吸收等，廣泛分布于消化道，在消化道水分的轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。而AQPs在結(jié)腸的異常表達(dá)，使得結(jié)腸中水的重吸收過多，分泌過少，可能是導(dǎo)致慢傳輸型便秘的主要原因之一[7]。眾多國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)認(rèn)為，與便秘相關(guān)的主要是AQP3和AQP8。

AQP3和AQP8分布于腸上皮細(xì)胞內(nèi)，可吸收腸腔內(nèi)水分，改變腸腔的內(nèi)分泌環(huán)境。研究表明，便秘患者結(jié)腸中AQP3表達(dá)升高，使得結(jié)腸中水分重吸收增多，大便干燥，傳輸速度減慢，時(shí)間延長(zhǎng)[8-9]。AQP8在結(jié)腸水分轉(zhuǎn)運(yùn)過程中也起了重要作用，在腹瀉患者結(jié)腸中表達(dá)降低，在便秘患者結(jié)腸中表達(dá)明顯升高[10-11]。目前在臨床上，朱氏潤(rùn)腸方對(duì)便秘療效顯著，停藥后未見明顯反彈。在解除便秘的同時(shí)，調(diào)整了紊亂的胃腸功能，并使患者的體質(zhì)狀況得到改善，是否與水通道蛋白調(diào)節(jié)腸道水液代謝有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)中通過免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，STC大鼠結(jié)腸AQP3和AQP8的表達(dá)明顯升高，而朱氏潤(rùn)腸方可以降低AQP3和AQP8的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，朱氏潤(rùn)腸方可以通過降低AQP3和AQP8的表達(dá)改善STC癥狀。

朱氏潤(rùn)腸方如何可以降低AQP3和AQP8的表達(dá)？本文進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)欲探索可能的作用機(jī)制。眾多研究證實(shí)，PI3K(磷脂酰肌醇3激酶) /akt(蛋白激酶B)信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等方面起到了重要作用。李旻昊[12]和孫路強(qiáng)[13]等證實(shí)，PI3K /akt通路在慢傳輸型便秘中也起關(guān)鍵作用，當(dāng)便秘發(fā)生時(shí)PI3K和akt的表達(dá)明顯增加。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明，發(fā)生慢傳輸型便秘后，機(jī)體釋放出神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等激活具有酪氨酸激酶活性的受體，隨即特異性地結(jié)合PI3K調(diào)節(jié)亞基，激活后的PI3K可以使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化生成第二信使，結(jié)合其下游的效應(yīng)分子akt，使akt的Thr308位點(diǎn)以及Ser473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，由抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)成為p-akt[14]。p-akt作用于下游水通道蛋白AQP3和AQP8，增加腸道對(duì)水的重吸收，使大便干燥造成便秘[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢傳輸型便秘大鼠腸道磷酸化的PI3K和akt表達(dá)明顯增多，下游水通道蛋白AQP3和AQP8的表達(dá)也明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。經(jīng)朱氏潤(rùn)腸方干預(yù)之后，PI3K/akt的磷酸化水平降低，水通道蛋白AQP3和AQP8表達(dá)也降低，便秘癥狀得到改善。

綜上所述，朱氏潤(rùn)腸方對(duì)慢傳輸型便秘具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能是通過抑制PI3K/akt信號(hào)通路，從而降低AQP3和AQP8的表達(dá)，減少腸道對(duì)水的重吸收，增加腸液的分泌，改善腸腔的內(nèi)分泌環(huán)境。本研究為傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方的發(fā)展提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，深入的分子機(jī)制研究與靶點(diǎn)治療將是下一步的研究重點(diǎn)。