戰(zhàn)旭梅，劉萍，祁興普，左成俊

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

隨著人民生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)與身體健康關(guān)系的認(rèn)識(shí)更加深入，對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)的要求也逐漸提高。玉米活性肽具有天然、易被人體消化吸收、抗氧化等優(yōu)良特性，符合消費(fèi)者對(duì)健康食品的基本要求[1-3]。

玉米活性肽是玉米蛋白的水解產(chǎn)物，利用酶法對(duì)玉米蛋白進(jìn)行水解生產(chǎn)的玉米肽具有高效性、安全性等特點(diǎn)[2]，另外，還可以利用其抗疲勞、抗氧化、促進(jìn)乙醇代謝等活性[3-5]，開(kāi)發(fā)成運(yùn)動(dòng)飲料、醒酒飲料等功能性食品。

但是，玉米蛋白水解后變?yōu)橛衩纂臅?huì)呈現(xiàn)出原來(lái)沒(méi)有的苦味，苦味形成的主要原因是疏水性氨基酸殘基的暴露。一般天然蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)常藏于分子內(nèi)部，不會(huì)呈苦味，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解成小分子肽時(shí)，疏水性氨基酸殘基暴露，與味蕾上的受體蛋白緊密接觸，產(chǎn)生苦味[6]，因此，限制了玉米活性肽在食品中的應(yīng)用。

本文分別采用風(fēng)味酶酶切法和活性炭吸附法對(duì)玉米活性肽脫苦進(jìn)行研究。比較了2種方法對(duì)玉米活性肽脫苦效果的影響，旨在探求一種脫苦效果好的方法，對(duì)玉米活性肽在食品中的應(yīng)用推廣提供實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉：河北興隆植物油有限公司，粗蛋白含量為60.29%；堿性內(nèi)切蛋白酶（2.4AU/g）、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（1 000 LAPU/g）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PRIMOR高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司；LABCONCO-6L冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 濃縮玉米蛋白的制備

玉米蛋白粉→按料液比1∶15（g/mL）加入堿醇液[由0.1 mol/L NaOH與95%乙醇按45∶55（體積比）配制]→于55℃水浴中回流浸提→過(guò)濾→浸提液按1∶1（體積比）加水→調(diào)pH值至6.4→按5∶1（體積比）加2%NaCl溶液鹽析→3 000 r/min離心10 min→取沉淀部分于低于60℃烘干→研細(xì)，過(guò)80目篩→玉米濃縮蛋白粉，備用[7]。

1.3.2 玉米粗肽（crude cornpeptide，CCP）的制備

玉米濃縮蛋白粉適量→加水[料液按1∶10（g/mL）配制]→95℃～100℃預(yù)變性10 min→冷卻→調(diào)pH值至8.0，溫度至55℃→加入0.5%的堿性內(nèi)切蛋白酶酶解4 h→沸水浴10 min使酶滅活→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→備用。

1.3.3 風(fēng)味酶法脫苦試驗(yàn)方法

玉米濃縮蛋白粉→加水 [料液按1∶10配制（g/mL）]→95℃～100℃預(yù)變性10 min→冷卻→調(diào)pH值至6.5，溫度至50℃→加入風(fēng)味蛋白酶酶解4 h→沸水浴10 min滅酶活→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→對(duì)樣品進(jìn)行苦味評(píng)價(jià)

1.3.4 風(fēng)味蛋白酶脫苦試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

以玉米活性肽苦味值的作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別討論pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶底比 E/S（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）的脫苦效果?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果選取3個(gè)適宜水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以苦味值為指標(biāo)，確定風(fēng)味酶脫苦的最佳條件。

1.3.5 活性炭脫苦試驗(yàn)方法

取一定量的玉米粗肽（CCP），按料液比 1∶10（g/mL）加水配成溶液，加入活性炭，調(diào)節(jié)pH值、溫度，連續(xù)攪拌以使活性炭不沉淀為宜，攪拌2 h后過(guò)濾除去活性炭，真空濃縮，冷凍干燥，成品評(píng)定苦味。活性炭在使用前，先置于120℃的烘箱中活化4 h以上。

1.3.6 活性炭脫苦試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

以玉米活性肽苦味值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別討論pH值（1、2、3、4、5、6、7、8）、溫度（30、35、40、45、50、55、60、65℃）、活性炭添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）的脫苦效果?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果選取3個(gè)適宜水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以玉米活性肽苦味值為指標(biāo)，確定活性炭脫苦的最佳條件。

1.3.7 玉米活性肽苦味的評(píng)價(jià)方法

采用感官評(píng)定的方法，稱取1 g玉米粗肽（CCP），溶于100 mL的純水中，制備成玉米肽（CCP）溶液提供給20名品嘗者（男、女各10名，20歲～30歲，均為不吸煙者），按照GB/T 12312-2012《感官分析味覺(jué)敏感度的測(cè)定方法》的方法，將結(jié)晶咖啡因（一水合物，分子量212.12）配成不同的濃度，見(jiàn)表1，根據(jù)此評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，品嘗CCP溶液，并與標(biāo)準(zhǔn)比較評(píng)定苦味值，最后取平均值作為玉米活性肽最終苦味值。

表1 感官評(píng)定苦味標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Bitter standard by sensory evaluation

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味蛋白酶酶解對(duì)玉米活性肽脫苦效果的影響

玉米蛋白水解為玉米粗肽時(shí)，疏水性氨基酸殘基暴露出來(lái)，使玉米肽呈現(xiàn)苦味，疏水性氨基酸主要位于肽的末端，如果切除此類疏水性氨基酸，肽的苦味將會(huì)明顯下降，這是采用酶切法脫除蛋白水解物中苦味的基礎(chǔ)[8]。風(fēng)味蛋白酶酶主要為外切蛋白酶，能夠催化水解肽鏈末端的疏水性氨基酸，從而降低酶解產(chǎn)物的苦味強(qiáng)度[9]。

2.1.1 酶解pH值對(duì)玉米活性肽苦味值的影響

在酶底比E/S為1.5%，酶解時(shí)間為4 h的條件下，試驗(yàn)pH值對(duì)苦味值的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值對(duì)玉米肽苦味值的影響Fig.1 Effect of pH value on corn peptide bitterness

由圖1可知，在pH值小于6.5時(shí)，苦味值隨溶液pH值升高而逐漸下降，當(dāng)pH值達(dá)到6.5時(shí)，苦味值最小，當(dāng)pH值大于6.5后，隨著pH值的升高，苦味值緩慢上升，苦味脫除效果減弱。因?yàn)閜H值的變化，改變了風(fēng)味蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，從而使其活性降低，水解能力變?nèi)酰源_定風(fēng)味蛋白酶脫苦的最適pH值為6.5。

2.1.2 酶底比（E/S）對(duì)玉米活性肽苦味值的影響

在pH值為6.5，酶解時(shí)間為4 h的條件下，試驗(yàn)酶底比（E/S）對(duì)苦味值的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶底比（E/S）對(duì)玉米肽苦味值的影響Fig.2 Effect of the ratio of enzyme to substrate（E/S）on corn peptide bitterness

隨著酶底比（E/S）的增加，風(fēng)味蛋白酶的水解能力變強(qiáng)，玉米活性肽苦味下降，到1.5%后繼續(xù)增加酶底比（E/S），玉米肽的苦味值變化緩慢，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，確定最酶底比（E/S）為1.5%。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)玉米活性肽苦味值的影響

在酶底比（E/S）為1.5%，pH值為6.5的條件下，試驗(yàn)酶解時(shí)間對(duì)玉米活性肽苦味值的影響。結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，隨著酶解時(shí)間的增加，玉米肽的苦味值迅速下降，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到4 h后，再繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，苦味值基本不變，說(shuō)明玉米蛋白基本水解完全，所以確定最適的酶解時(shí)間為4 h。

2.1.4 風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以玉米肽的苦味值為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表2，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)玉米肽苦味值的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on corn peptide bitterness

表2 風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Level table of orthogonal experimental factors for corn peptide bitterness removal by flavor protease enzymatic hydrolysis

由表3可知，風(fēng)味蛋白酶水解玉米蛋白對(duì)所產(chǎn)生玉米肽苦味值影響因素的主次順序?yàn)椋築＞C＞A，即酶底比（E/S）＞酶解時(shí)間＞pH值，最佳的試驗(yàn)方案為A1B2C1，即 pH 6.0，酶底比（E/S）1.5%，酶解時(shí)間 3 h。

驗(yàn)證試驗(yàn)：根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在次條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到玉米活性肽的苦味值平均值為1.07，基本嘗不出苦味。

2.2 活性炭吸附對(duì)玉米活性肽脫苦效果的影響

活性炭是一種多孔性含碳物質(zhì)，具有很強(qiáng)的吸附能力，在食品工業(yè)等方面應(yīng)用廣泛。

2.2.1 溶液pH值對(duì)玉米活性肽苦味值的影響

在溫度55℃，活性炭添加量3.5%的條件下，試驗(yàn)溶液的pH值對(duì)玉米活性肽苦味值的影響。結(jié)果如圖4所示。

表3 風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment of corn peptide bitterness removal by flavor protease enzymatic hydrolysis

圖4 溶液pH值對(duì)玉米肽苦味值的影響Fig.4 Effect of pH value on corn peptide bitterness

由圖4可知，在pH值小于5.0時(shí)，玉米肽的苦味值隨溶液pH值升高而降低，當(dāng)pH值達(dá)到5.0時(shí)苦味值達(dá)到最小值，然后pH值增加，苦味脫除效果減弱。是因?yàn)榛钚蕴吭谒嵝詶l件下的吸附能力比在堿性條件下的吸附能力大，因此，確定溶液pH值5.0時(shí)，活性炭的脫苦效果最好。

2.2.2 活性炭用量對(duì)玉米活性肽苦味值的影響

在溫度55℃，溶液pH 5.0的條件下，試驗(yàn)活性炭用量對(duì)玉米肽苦味值的影響。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，玉米肽的苦味值與活性炭用量成反比。活性炭用量增加，玉米肽的苦味值逐漸降低，當(dāng)活性炭用量為3.5%時(shí)，玉米肽溶液的苦味值已降低為1，基本嘗不出苦味。繼續(xù)增加活性炭的用量，苦味值基本不變，從降低成本的角度出發(fā)，選擇活性炭用量為3.5%。

圖5 活性炭用量對(duì)玉米肽苦味值的影響Fig.5 Effect of activated carbon dosage on corn peptide bitterness

2.2.3 溫度對(duì)玉米活性肽苦味值的影響

在溶液pH 5.0，活性炭用量為3.5%的條件下，試驗(yàn)溫度對(duì)玉米活性肽苦味值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 溫度對(duì)玉米活性肽苦味值的影響Fig.6 Effect of temperature on corn peptide bitterness

由圖6可以看出，在30℃～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度增加，苦味值逐漸下降，到達(dá)55℃以后再增加溫度就基本上沒(méi)什么效果了，反而如果溫度太高，會(huì)吸附玉米肽，造成玉米肽的損失。因此，選擇活性炭脫苦的最佳溫度為55℃。

2.2.4 活性炭吸附去除玉米肽苦味的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以玉米肽的苦味值為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表4，分析結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，活性炭吸附對(duì)玉米肽苦味值影響的主次順序?yàn)椋築＞C＞A，即活性炭添加量＞溫度＞pH值，最佳的試驗(yàn)方案為A2B1C3，即活性炭添加量3.0%，溫度 60℃，pH 5.0。

表4 活性炭吸附去除玉米肽苦味的正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Orthogonal experimental factor level table of corn peptide bitter removal by activated carbon adsorption

驗(yàn)證試驗(yàn)：根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在次條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到玉米活性肽的苦味值平均值為1.27，基本嘗不出苦味。

表5 活性炭吸附去除玉米肽苦味的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of corn peptide bitterness removal by activated carbon adsorption

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了風(fēng)味蛋白酶和活性炭對(duì)玉米活性肽脫苦效果的研究，以得到玉米活性肽的苦味值為指標(biāo)，試驗(yàn)得到最佳條件是：風(fēng)味蛋白酶在pH6.0，酶底比（E/S）1.5%，酶解時(shí)間3 h，得到玉米活性肽苦味值為1.07，已基本嘗不出苦味；活性炭在玉米活性肽溶液pH 5.0，溫度60℃，活性炭添加量3.0%，吸附2 h，得到得到玉米活性肽苦味值為1.27，與風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味此效果相差不顯著，但是，活性炭具有良好的吸附功能，除了可以吸附玉米活性肽的苦味，難免會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)的損失，因此，根據(jù)研究、生產(chǎn)的實(shí)際情況，選擇合適的脫苦方法。