梁興林 夏瑞祥 曾慶曙 楊明珍 李慶生

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP) 是一種免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞所致的出血性疾病[1]。B細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中執(zhí)行多重功能，包括遞呈抗原、分泌抗體和各種細(xì)胞因子等。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell,Breg) 是一類具有免疫抑制功能的B細(xì)胞亞群，參與維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，并且在各種免疫病理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell,Tfh)為新近發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，是輔助生發(fā)中心B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的主要細(xì)胞[2]，其作用可被濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(follicular regulatory T cell,Tfr)所抑制[3]。多種自身免疫性疾病的發(fā)生與Tfr細(xì)胞分化不足、Tfh細(xì)胞數(shù)量增多及Tfr/Tfh失衡有關(guān)[4-5]。研究[6]顯示，Breg細(xì)胞通過分泌白介素-10(interleukin-10,IL-10)調(diào)控著Tfh細(xì)胞和Tfr 細(xì)胞在二級淋巴器官的分化和遷移。本文通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測ITP中Breg、Tfh、Tfr細(xì)胞的表達(dá)水平，探討B(tài)reg、Tfh、Tfr在ITP發(fā)病機(jī)制中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年10月至2019年10月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的初次診斷的30例ITP患者為ITP組，所有患者均符合中國《原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療專家共識(2016年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中，女性19例，男性11例，年齡16～76歲，平均(36.25±11.62)歲。選擇同期健康體檢者25例作為健康對照組，其中，女性15例，男性10例，年齡18～68歲，平均(38.21±15.37)歲。兩組對象一般資料進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入研究對象均排除具有藥物過敏史、自身免疫性疾病及糖皮質(zhì)激素應(yīng)用史等。

1.2 檢測試劑 Breg相關(guān)流式單抗CD19-PECy7、CD24-PE、CD38-FITC、IL-10-APC和Tfh/Tfr相關(guān)流式單抗CD4-FITC、CXCR5-PE、ICOS-710、Foxp3-APC均購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集和處理 治療前，取兩組對象靜脈血5 mL，肝素抗凝。應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

1.3.2 FCM檢測外周血Breg細(xì)胞 取已分離的PBMC，加入培養(yǎng)液，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌，加入熒光標(biāo)記的CD19-PECy7、CD24-PE和CD38-FITC單抗，避光染色30 min，PBS洗滌后，加固定液，避光保存30 min，PBS洗滌后，加入破膜劑和IL-10-APC，避光胞內(nèi)染色20 min，PBS洗滌后，上流式細(xì)胞儀(FACSCanto,BD公司)檢測，CD19+CD24hiCD38hi細(xì)胞群為Breg細(xì)胞，CD19+CD24hiCD38hiIL-10+就是分泌IL-10的Breg細(xì)胞。

1.3.3 FCM檢測外周血中Tfh和Tfr 細(xì)胞 取已分離的PBMC，分別加入熒光標(biāo)記的CD4-FITC、CXCR5-PE和ICOS-710單抗，避光孵育30 min，加入固定液，避光保存30 min， PBS洗滌離心后，加入破膜劑和Foxp3-APC，避光胞內(nèi)染色20 min，PBS洗滌后，上流式細(xì)胞儀檢測，CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞群為Tfh細(xì)胞，CD4+Foxp3+CXCR5+ICOS+細(xì)胞群為Tfr 細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo) 采集兩組對象外周血進(jìn)行FCM檢測，應(yīng)用FlowJo V10.0軟件分析，測定Breg細(xì)胞、分泌IL-10的Breg細(xì)胞、Tfh細(xì)胞和Tfr細(xì)胞的百分比，并計算Tfr/Tfh的比值。

2 結(jié)果

2.1 外周血Breg細(xì)胞表達(dá)水平、IL-10+Breg細(xì)胞比例比較 ITP組患者外周血CD19+B細(xì)胞中，Breg細(xì)胞表達(dá)水平、IL-10+Breg的比例均低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組對象外周血Breg表達(dá)水平、IL-10+ Breg細(xì)胞比例比較

圖1 兩組研究對象Breg與IL-10+ Breg的FCM檢測結(jié)果

2.2 外周血Tfh、Tfr 細(xì)胞表達(dá)水平及Tfr/Tfh比較 ITP組患者外周血CD4+T細(xì)胞中Tfh細(xì)胞表達(dá)水平高于健康對照組，Tfr細(xì)胞表達(dá)水平低于健康對照組，Tfr/Tfh低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 兩組對象外周血Tfh、Tfr 細(xì)胞表達(dá)水平及Tfr/Tfh比較

圖2 兩組研究對象Tfh與Tfr的FCM檢測結(jié)果

3 討論

ITP發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究[7-8]顯示，B淋巴細(xì)胞分泌的血小板自身抗體是ITP的主要發(fā)病原因，結(jié)合自身抗體的血小板最終被機(jī)體的單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)所清除，從而導(dǎo)致外周血血小板減少。闡明血小板自身抗體產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制，對明確ITP的發(fā)病機(jī)理及治療有重要的意義。本文通過FCM檢測Breg、Tfh、Tfr細(xì)胞在ITP患者中的表達(dá)，探討B(tài)reg、Tfh、Tfr在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。

邊緣區(qū)來源的Breg細(xì)胞通過分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β控制初始T細(xì)胞向Tfh、Tfr 細(xì)胞的分化[9]。有研究[10]顯示，ITP患者體內(nèi)Breg細(xì)胞表達(dá)明顯下降，其分泌IL-10的功能也隨之降低，抑制單核細(xì)胞活化的能力受損。狄正霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ITP組患者血清Breg細(xì)胞表達(dá)水平較健康對照組低，初診ITP組IL-10 mRNA水平較健康對照組明顯減低，治療后其IL-10 mRNA水平較治療前顯著升高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初診成人ITP患者對比健康對照組，外周血Breg細(xì)胞數(shù)量和IL-10+Breg細(xì)胞比例下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與上述結(jié)果相同。Breg細(xì)胞水平的下降可導(dǎo)致Tfh和Tfr細(xì)胞比例失衡。

B淋巴細(xì)胞的活化及分化需要Th細(xì)胞提供第二信號及分泌細(xì)胞因子，Th細(xì)胞在體液免疫中具有重要作用，但Th細(xì)胞的本質(zhì)一直未明確。研究[4]發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞在生發(fā)中心與B細(xì)胞相互作用，并主要通過分泌多種細(xì)胞因子來調(diào)控B細(xì)胞的增殖分化、Ig類型轉(zhuǎn)換和抗體親和力成熟。Tfr 細(xì)胞表面同時高表達(dá)Treg細(xì)胞相關(guān)分子和Tfh細(xì)胞相關(guān)分子，在功能上，Tfr 細(xì)胞具有Tfh細(xì)胞及Treg細(xì)胞的雙重特性，可以調(diào)節(jié)Tfh數(shù)目、控制生發(fā)中心的反應(yīng)、防止自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生。研究[12]發(fā)現(xiàn)，Graves病、SLE、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力等多種自身免疫性疾病患者外周血存在Tfh和Tfr 細(xì)胞數(shù)量異常。在兒童ITP患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，Tfr 細(xì)胞和Tfr/Tfh明顯減低，且與外周血血小板計數(shù)呈正相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，ITP患者外周血Tfh細(xì)胞水平比健康對照組升高，而Tfr細(xì)胞出現(xiàn)下降，Tfr/Tfh降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。成人ITP患者Breg細(xì)胞數(shù)量及IL-10+Breg細(xì)胞比例下降，引起Tfh和Tfr細(xì)胞比例失衡，可以進(jìn)一步影響B(tài)淋巴細(xì)胞分化成熟異常及血小板自身抗體的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致患者血小板減少。

綜上所述，ITP患者外周血Breg細(xì)胞減少，IL-10分泌降低，造成Tfr/Tfh比例失衡，從而影響B(tài)細(xì)胞的分化增殖，最終導(dǎo)致血小板抗體分泌過多，這可能是ITP發(fā)病機(jī)制之一。深入研究ITP患者Breg、Tfh和Tfr細(xì)胞相互作用的調(diào)控機(jī)制，對闡明ITP的發(fā)病機(jī)制和提供新的治療思路有重要的意義。