楊 李 王寶田 唐久來(lái) 吳 德

Rett綜合征是一種主要累及女性患兒，嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)及智力發(fā)育的遺傳性罕見(jiàn)病，女童患病率為1/15 000～1/10 000，男性患兒更為罕見(jiàn)，約95%的患兒由位于X染色體長(zhǎng)臂上的甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，MECP2)基因突變所導(dǎo)致，其他如細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶5(cyclin-dependent kinase like 5，CDKL5)、叉頭盒蛋白G1(forkhead box protein G1，F(xiàn)OXG1)等基因突變也可導(dǎo)致本病的發(fā)生[1]。典型Rett綜合征經(jīng)過(guò)早期的正常發(fā)育至6～18個(gè)月齡后，出現(xiàn)已獲得技能的迅速退化、典型手部運(yùn)動(dòng)、小頭畸形、自閉癥、共濟(jì)失調(diào)以及呼吸節(jié)律紊亂等；除了典型Rett綜合征外，還有非典型的變異型，如先天性變異型、恢復(fù)部分言語(yǔ)能力的語(yǔ)言保留型及早發(fā)癲癇型[1-2]。本研究總結(jié)Rett綜合征臨床表現(xiàn)、分析突變基因，擴(kuò)展臨床表型，提高對(duì)本病的早期診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2017年1月至2019年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科就診，明確診斷為Rett綜合征的患兒，收集臨床資料，病例采集前患兒監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書(shū)。

病例1：女性，診斷年齡3歲7個(gè)月，系第1胎第1產(chǎn)，患兒1歲余可獨(dú)走，但僅能無(wú)意識(shí)發(fā)“ba、ma”音，曾以“孤獨(dú)癥”外院治療，約2歲半時(shí)出現(xiàn)顯著倒退，表現(xiàn)為獨(dú)走不穩(wěn)，出現(xiàn)雙手反復(fù)交替用手指觸碰舌頭后放下的手部刻板動(dòng)作，不再主動(dòng)抓物，僅會(huì)發(fā)“a”音，不與人交流。3歲6個(gè)月出現(xiàn)癲癇，全面性強(qiáng)直發(fā)作，現(xiàn)接受抗癲癇藥物與生酮飲食治療。父母表型正常，否認(rèn)家族史。

病例2：女性，診斷年齡1歲3個(gè)月，系第2胎第2產(chǎn)， 6～13個(gè)月期間身高增長(zhǎng)緩慢，僅2 cm，現(xiàn)不會(huì)爬行，可扶站，無(wú)意識(shí)發(fā)“ba、ma”音，手部精細(xì)動(dòng)作差，伴有刻板動(dòng)作搓手、磨牙，頭圍43 cm，睡眠質(zhì)量較差、節(jié)律紊亂，易激惹?；純航憬?歲8個(gè)月表型正常，父母表型正常，否認(rèn)家族史。

病例3：女性，診斷年齡2歲，系第1胎第1產(chǎn)，6月齡前發(fā)育基本正常，1歲2個(gè)月時(shí)家長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)患兒只會(huì)無(wú)意識(shí)發(fā)“yi、ya”音，雙手出現(xiàn)無(wú)法穩(wěn)定抓握，1歲5個(gè)月出現(xiàn)手部刻板動(dòng)作，喜搓手、用手拍頭，與人交流欠佳，現(xiàn)患兒2歲，偶喜尖叫，與人無(wú)眼神交流，多動(dòng)，手部刻板動(dòng)作無(wú)改善，獨(dú)走欠穩(wěn)。父母表型正常，否認(rèn)家族史。

病例4：女性，診斷年齡4歲，系第2胎第1產(chǎn)，發(fā)育里程碑稍落后，2歲余可獨(dú)走，但姿勢(shì)異常，可有意識(shí)發(fā)“ye、ma”音，其后逐漸出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)認(rèn)知倒退，手拍口唇、搓手等刻板動(dòng)作，眼神呆滯，情緒易激動(dòng)，4歲時(shí)癲癇頻發(fā)，為全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作和復(fù)雜部分性發(fā)作。我院檢查示：高磷血癥、腎源性血尿；現(xiàn)接受抗癲癇藥物及生酮飲食治療。父母表型正常，否認(rèn)家族史。

病例5：男性，診斷年齡3歲1個(gè)月，系第1胎第1產(chǎn)，10月齡獨(dú)坐不穩(wěn)，無(wú)意識(shí)發(fā)“ba、ma”音，伴有通貫手，曾間斷隨訪于我科，1歲7個(gè)月獲獨(dú)坐能力，3歲1個(gè)月時(shí)已無(wú)法獨(dú)坐，不會(huì)發(fā)“ba、ma”音，四肢肌力、肌張力低下，出現(xiàn)脊柱側(cè)彎，睡眠節(jié)律紊亂，喜磨牙?；純耗赣H智力低下，無(wú)法生活自理，父親邊緣智力，基本生活與體力勞動(dòng)無(wú)障礙。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集患兒及父母全血2 mL，提取DNA并質(zhì)檢，合格后進(jìn)入分析步驟。

1.2.2 測(cè)序與生物信息學(xué)分析 構(gòu)建全外顯子文庫(kù)，通過(guò)illumina公司NovaSeq 6000系列測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序(PE150)，測(cè)序覆蓋度不低于99%。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)等軟件篩選及過(guò)濾，獲得可靠高質(zhì)量突變數(shù)據(jù)。對(duì)檢測(cè)到的突變數(shù)據(jù)進(jìn)行各大數(shù)據(jù)庫(kù)，如單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(the Single Nucleotide Polymorphism Database，dbSNP)、千人基因組(1000 Genomes Project)、外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)(the exome aggregation consortium,ExAC)、外顯子測(cè)序計(jì)劃(Exome Sequencing Project,ESP)等頻率數(shù)據(jù)庫(kù)，在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Gene Mutation Database,HGMD)、臨床相關(guān)的序列變異(Clinically Relevant Sequence Variations, ClinVar)等的關(guān)聯(lián)注釋。借助Provean、Polyphen2-HVAR、SIFT、Revel、M-Cap等蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行危害性分析，篩選可能影響蛋白結(jié)構(gòu)的有害變異。

1.2.3 Sanger法一代測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)需要驗(yàn)證的位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，PCR技術(shù)擴(kuò)增，對(duì)患兒及其父母樣本測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 危害性評(píng)級(jí) 根據(jù)注釋信息、頻率數(shù)據(jù)庫(kù)等依據(jù)美國(guó)遺傳學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics,ACMG)2015診斷指南，綜合評(píng)定危害等級(jí)為5級(jí)：致病、可能致病、良性、可能良性及意義未明。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn) 病例1～4均符合典型Rett綜合征的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，病例5符合非典型Rett綜合征臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，見(jiàn)表1。病例1除了典型Rett綜合征的表現(xiàn)外，同時(shí)伴發(fā)有癲癇；病例2頭圍43 cm，低于正常同齡兒童2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；病例4伴有癲癇、堿性磷酸酶升高、高磷血癥、腎源性血尿；病例5為男性患兒，雖然該病例1歲2個(gè)月即明確存在致病突變，但至3歲后癥狀趨于明顯。

續(xù)表1

2.2 分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果

病例1：檢測(cè)到一個(gè)位于X染色體的雜合基因突變 MECP2[c.808(exon4)C>T，p.Arg270Stop，217]，即第808號(hào)核苷酸由C突變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物的第270號(hào)的精氨酸以后的217個(gè)氨基酸無(wú)法翻譯。Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變?；純焊改干鲜鑫稽c(diǎn)均未檢測(cè)到變異，故屬新生變異，綜合評(píng)定危害等級(jí)：致病。Sanger測(cè)序驗(yàn)證見(jiàn)圖1-A。

病例2：檢測(cè)到一個(gè)位于X染色體的雜合基因突變MECP2[c.763(exon4)C>T，p.Arg255Stop，232]，即第763號(hào)核苷酸由C突變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物的第255號(hào)的精氨酸以后的232個(gè)氨基酸無(wú)法翻譯。Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變?；純焊改干鲜鑫稽c(diǎn)均未檢測(cè)到變異，故屬新生變異，綜合評(píng)定危害等級(jí)：致病。Sanger測(cè)序驗(yàn)證見(jiàn)圖1-B。

病例3：檢測(cè)到一個(gè)位于X染色體的雜合基因突變MECP2[c.799(exon3)C>T，p.Arg267Stop，220]，即第763號(hào)核苷酸由C突變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物第267號(hào)的精氨酸以后的220個(gè)氨基酸無(wú)法翻譯。Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變，PubMed查詢(xún)到該變異致病性的文獻(xiàn)報(bào)道。患兒父母上述位點(diǎn)均未檢測(cè)到變異，故屬新生變異，綜合評(píng)定危害等級(jí)：致病。Sanger測(cè)序驗(yàn)證見(jiàn)圖1-C。

病例4：檢測(cè)到一個(gè)位于X染色體的雜合基因突變MECP2[c.916(exon4)C>T，p.Arg306Cys]，即第916號(hào)核苷酸由C突變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物第306號(hào)氨基酸的精氨酸翻譯成半胱氨酸。Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變?；純焊改干鲜鑫稽c(diǎn)均未檢測(cè)到變異，故屬新生變異，綜合評(píng)定危害等級(jí)：致病。Sanger測(cè)序驗(yàn)證見(jiàn)圖1-D。

圖1 突變Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

病例5：檢測(cè)到一個(gè)位于X染色體的半合子基因突變MECP2[c.1148(exon4)_c.1198(exon4)del，insC，p.Leu383Profs*5]從編碼序列1 148位置到1 198位置缺失50個(gè)堿基，導(dǎo)致其翻譯產(chǎn)物從第383位異亮氨酸開(kāi)始，再翻譯5個(gè)氨基酸后終止；經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(Provean、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster)2種以上統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測(cè)該變異對(duì)基因及產(chǎn)物有影響。在正常人數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP、千人南方、千人基因、ExAC等)中未見(jiàn)收錄，OMIM、HGMD、Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)性報(bào)道?；純焊赣H為野生型，母親為雜合，故該患兒致病突變來(lái)源于其母親，綜合評(píng)定危害等級(jí)：致病。Sanger測(cè)序驗(yàn)證見(jiàn)圖2。

圖2 突變Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

Rett綜合征是一種以運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言發(fā)育退化，以及典型的手部刻板動(dòng)作等為特征的遺傳性疾病，上世紀(jì)60年代奧地利醫(yī)生Rett首次報(bào)道[3]。Rett綜合征患兒早期生長(zhǎng)發(fā)育史大致正常，但隨后出現(xiàn)非連續(xù)性的病程進(jìn)展，包括：停滯期、快速退化期、平臺(tái)期及后期運(yùn)動(dòng)退化期4個(gè)階段。在快速退化期，患兒會(huì)部分或者全部喪失有目的的手部功能和語(yǔ)言能力，同時(shí)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、呼吸異常，自閉特征逐漸顯現(xiàn)，以及癲癇發(fā)作等[2,4]。

Rett綜合征公認(rèn)并且最新的診斷標(biāo)準(zhǔn)是(國(guó)際)Rett研究聯(lián)盟(Rett Search Consortium)于2002年診斷標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上2010年再行修訂的版本，標(biāo)準(zhǔn)中指出：臨床診斷典型Rett綜合征需滿(mǎn)足全部的主要標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，雖然支持標(biāo)準(zhǔn)在典型Rett綜合征中較為常見(jiàn)，但不是診斷的必要條件；而非典型Rett的診斷確立需至少滿(mǎn)足2條主要標(biāo)準(zhǔn)，且同時(shí)達(dá)到5條支持標(biāo)準(zhǔn)。由于標(biāo)準(zhǔn)中所羅列的臨床特征多具有年齡依賴(lài)性，即臨床表現(xiàn)到一定年齡階段才會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)[2]，低年齡兒童的診斷的難度要大于年長(zhǎng)兒。因此，在實(shí)際臨床工作中基因?qū)W檢測(cè)有助早期診斷，本研究病例2、病例5是基于基因?qū)W的早期診斷，其中病例5早期診斷 “可能非典型Rett綜合征”，后期隨訪中其臨床癥狀趨于明顯，診斷為“不典型Rett綜合征”。

癲癇雖未列于診斷標(biāo)準(zhǔn)中，卻是Rett綜合征常見(jiàn)的臨床表型。60%～80%的Rett綜合征患兒合并癲癇，在非典型Rett綜合征和嚴(yán)重表型的Rett綜合征患兒中發(fā)病率更高，常見(jiàn)的發(fā)作類(lèi)型為復(fù)雜部分性以及全面性強(qiáng)直發(fā)作[5]。本研究中，病例1為全面性強(qiáng)直發(fā)作，病例4為復(fù)雜部分性以及全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。需要指出的是，Rett綜合征的呼吸節(jié)律紊亂可導(dǎo)致呼吸暫停、發(fā)紺、凝視，以及肌張力障礙等類(lèi)似癲癇癥狀。本研究病例4同時(shí)伴有堿性磷酸酶升高、高磷血癥、腎源性血尿，但該患兒未見(jiàn)有其他未明意義突變關(guān)聯(lián)表型，且既往文獻(xiàn)中未見(jiàn)描述，本研究為首次報(bào)道該表型。

Rett綜合征絕大多數(shù)是由位于X染色體長(zhǎng)臂上MECP2基因突變所致，約5%的患兒攜帶突變基因CDLK5、FOXG1或癲癇或智力障礙相關(guān)的突變基因。本研究中病例均為MECP2基因突變所致，其中病例1、2、3、4在Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定相同的致病變異，或者有同樣的氨基酸改變[6-7]；病例5為較為罕見(jiàn)的男性患兒，其突變遺傳于有表型母親，尚無(wú)相同突變的文獻(xiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)報(bào)道1例MECP2基因突變致Rett綜合征男童于18月齡時(shí)因“呼吸衰竭”死亡[8]。由于MECP2基因位于X染色體上，其突變被認(rèn)為對(duì)發(fā)育中的男性胎兒及出生后男嬰是致命的，故Rett綜合征的男性數(shù)量較少，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)較大樣本Rett綜合征回顧性研究對(duì)象也均是女性患兒[7]。

MECP2編碼甲基-CPG結(jié)合蛋白2，為核蛋白的一種，在每個(gè)組織細(xì)胞中均有表達(dá)，在神經(jīng)元中尤其豐富，主要負(fù)責(zé)翻譯后的修飾作用。MECP2作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子特異性地與甲基化DNA結(jié)合，募集蛋白伴侶和調(diào)節(jié)復(fù)合物來(lái)修飾轉(zhuǎn)錄活性。MECP2有3個(gè)主要的功能域：甲基CpG結(jié)合域(methyl-CpG-binding domain，MBD)、轉(zhuǎn)錄抑制域(transcription repression domain,TRD)、C終端域( C-terminal domain,CTD)。本研究中，病例1、2、3、4突變位于TRD區(qū)域，可導(dǎo)致該區(qū)域蛋白結(jié)構(gòu)的改變，影響與甲基化的 DNA結(jié)合，進(jìn)而影響MECP2轉(zhuǎn)錄抑制功能；病例5的突變位于CTD區(qū)域，突變可所致的結(jié)構(gòu)改變，影響介導(dǎo)染色質(zhì)折疊能力(見(jiàn)圖3)，參考文獻(xiàn)[9]繪制。除了突變位點(diǎn)外，突變類(lèi)型也是影響表型的重要因素，MECP2基因突變致所編碼蛋白氨基酸截短突變的臨床表型最為嚴(yán)重，而大多數(shù)的末端截短突變與錯(cuò)義突變的臨床表型則較為溫和[9]。本研究中，3例患兒為氨基酸的截短突變，1例移碼突變，1例患兒為錯(cuò)義突變，但是錯(cuò)義突變病例4的表型仍較嚴(yán)重。由于Rett綜合征雜合女性患兒是正常和突變MECP2的嵌合體攜帶者，因此臨床表型的差異也與X染色體的差異性失活有關(guān)。同樣，修飾基因的突變也可能減輕或增強(qiáng)患者的臨床癥狀[10]，這可能是本例錯(cuò)義突變患兒表型仍較嚴(yán)重的原因。

圖3 MECP2突變位點(diǎn)示意圖

綜上，Rett綜合征是一種累及多器官系統(tǒng)的遺傳性疾病，目前尚無(wú)特異性有效治療手段，一些藥物仍然處在臨床前研究階段[11]，需要個(gè)體化的綜合康復(fù)治療，其中生酮飲食對(duì)癥狀有改善作用，尤其是合并癲癇的Rett患兒[11-12]。結(jié)合其遺傳學(xué)病因，目前有2種治療研究思路，一種直接針對(duì)MECP2突變，對(duì)MECP2下游通路的靶點(diǎn)進(jìn)行治療；另一個(gè)潛在途徑是基因療法，即將正常的MECP2導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行治療[4,9,13]。最近，一個(gè)靶向基因治療罕見(jiàn)遺傳性眼病Leber先天性黑矇在美國(guó)被批準(zhǔn)應(yīng)用，這可能也是未來(lái)治療Rett綜合征的重要方法[14]。