張光志 孫衛(wèi)強(qiáng)

椎間盤(pán)退變變性的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其是幾種脊柱疾病的主要原因，對(duì)生活質(zhì)量有很大影響[1]。大部分老年人口受到不可逆轉(zhuǎn)的椎間盤(pán)退變變性的影響：大約40%<30歲的人和>90%≥55歲的人患有腰椎中度至重度的椎間盤(pán)退變變性，需要進(jìn)行基本治療[2]。治療主要局限于非甾體類(lèi)抗炎藥和手術(shù)治療的癥狀緩解，因?yàn)橥嘶臋C(jī)制尚不完全清楚。加速研究和在椎間盤(pán)退變變性和下背部疼痛方面取得突破的可能步驟可能依賴(lài)于識(shí)別能力更準(zhǔn)確的動(dòng)物模型[3]。在幾種動(dòng)物模型中，小鼠椎間盤(pán)退變針穿刺模型已經(jīng)開(kāi)發(fā)了近10種。MMP-9是屬于鋅依賴(lài)性金屬蛋白酶的酶家族的成員，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起作用[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)的下游調(diào)節(jié)劑[5]。通過(guò)蛋白水解活化無(wú)活性酶原和通過(guò)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)抑制活性形式的酶，MMP活性在基因轉(zhuǎn)錄水平上受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)[6]。TIMP是MMP的特異性抑制劑，其參與調(diào)節(jié)MMP的活性。本文研究椎間盤(pán)退變大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子1表達(dá)及髓核超微結(jié)構(gòu)的變化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 該研究中使用的動(dòng)物是雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g(相當(dāng)于8～9周齡)，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 動(dòng)物倫理學(xué)問(wèn)題 所有實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)被分成2組：對(duì)照組(為正常健康大鼠，做假手術(shù)處理n=10)；模型組(如前所述做椎間盤(pán)退變手術(shù)并做磁共振成像檢查n=10)；2組大鼠相同環(huán)境下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h只對(duì)大鼠進(jìn)行清水飼養(yǎng)。

1.3.2 椎間盤(pán)退變大鼠模型構(gòu)建:將大鼠放置在俯臥位，并在背部進(jìn)行中線縱向切口。第四和第五腰椎之間的左小關(guān)節(jié)被移除?？梢暬疞4 DRG，L5神經(jīng)根和L4/5 IVD。將21號(hào)針頭平行插入端板，3.0 mm插入光盤(pán)，在那里保持30 s。夾子用作塞子以控制針的深度。用3-0絲線縫合肌肉，用4-0尼龍縫合線封閉皮膚邊緣。手術(shù)后1周，使用微量注射器(10 μl)通過(guò)前入路將8 μl(1.6 ng)TGF-β1注射到IVD中。手術(shù)后2周重復(fù)相同的程序。手術(shù)后0、2、4、6和8周進(jìn)行腰椎磁共振成像檢查。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血清中TIMP-1和MMP-9:評(píng)估所有實(shí)驗(yàn)大鼠的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)量大鼠血清MMP-9水平以及TIMP-1。當(dāng)血清培養(yǎng)變?yōu)殛幮詴r(shí)，在開(kāi)始抗生素治療后72 h獲得血清樣本。將樣品收集在無(wú)菌聚丙烯容器中。將等分試樣(1 ml)以4 000 g離心10 min，將上清液部分儲(chǔ)存在-80℃直至分析。根據(jù)制造商的說(shuō)明，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中MMP-9和TIMP-1的水平。在450 nm處獲得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值，并比較每個(gè)測(cè)定法構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線并用于最小化測(cè)定間變異。濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線外推并以ng/ml表示。MMP-9和TIMP-1的檢測(cè)下限為0.05 ng/ml。為了避免任何偏差，所有樣品一式兩份，以盲法分析，在96孔微量培養(yǎng)板上使用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品。

1.4.2 RNA提取和實(shí)時(shí)PCR分析:使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)分析MMP-9和TIMP-1基因在ANG處理中的表達(dá)。使用FAST Pure RNA提取試劑盒從細(xì)胞沉淀中分離RNA。使用Primescript RT酶將來(lái)自每個(gè)樣品的1 μg總RNA用于cDNA合成。使用RTPrimer數(shù)據(jù)庫(kù)中引用的特異性引物對(duì)和Taqman探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Rotor-gene 6000熱循環(huán)儀進(jìn)行反應(yīng)。穿梭PCR條件如下：在95℃下變性10 s和在59、60和62℃下退火/延伸40周期后，在95℃下初始變性15 s(對(duì)于TIMP-1，MMP-9和分別為GAPDH)25 s。針對(duì)β-actin表達(dá)對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并基于ΔΔCt計(jì)算進(jìn)行相對(duì)定量分析。還通過(guò)Rotor-gene 6000軟件進(jìn)行解鏈曲線分析以確保有利序列的特異性擴(kuò)增。用于PCR反應(yīng)的引物如下。見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡分析:樣本處理后立即將細(xì)胞置于冰上，并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次。將細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce，Billings，MT，USA)通過(guò)BCA測(cè)定提取和定量總蛋白質(zhì)。通過(guò)10%SDS-PAGE分離總細(xì)胞蛋白(每孔20 μg)，然后通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，Boston，MA，USA)。將膜用含有TBST的5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與以下一抗孵育過(guò)夜：抗ERK1/2抗體(1∶1 000)，抗-phospho-ERK1/2抗體(1∶1 000)和抗GAPDH抗體(CST)。用TBST洗滌后，將膜與抗兔或抗大鼠HRP偶聯(lián)的第二抗體一起溫育，隨后用ECL Plus試劑(Millipore)檢測(cè)。使用多規(guī)格光密度測(cè)定系統(tǒng)量化該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1.4.4 CCL3和CCL4的IHC染色:進(jìn)行IHC染色以確定2組CCL3和CCL4表達(dá)水平。手術(shù)后3周進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查。解剖方案類(lèi)似于我們先前研究中使用的方案。然后，將切片與兔抗大鼠多克隆CCL3抗體(1∶200稀釋)一起孵育。兔多克隆CCL4抗體(1∶200稀釋)，然后是生物素化的山羊抗兔IgG抗血清(1∶200稀釋)。洗滌后，將切片與生物素標(biāo)記的兔抗山羊抗體在室溫下孵育15 min，隨后與鏈霉抗生物素蛋白綴合的辣根過(guò)氧化物酶一起溫育。將切片進(jìn)一步與2,4-二氨基酸一起溫育。用附著在CCD點(diǎn)照相機(jī)上的熒光顯微鏡捕獲染色切片的圖像，并用Leica IM50軟件處理。

1.4.5 大鼠髓核細(xì)胞凋亡率測(cè)定:CCK-8測(cè)定用于細(xì)胞活力評(píng)估。將細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔鏗俛tbottomed微孔板中。溫育24 h后，分別用含有H2O2，COS或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;對(duì)照組)的DMEM/F-12替換培養(yǎng)基。分別用100,200,300和400 mmol/L H2O2處理細(xì)胞，不含COS，或300 mmol/L H2O2以及不同濃度的殼聚糖寡糖(50、100、200 mg/ml)。向含有100 ml DMEM/F-12的每個(gè)孔中加入10 ml CCK-8試劑以分析細(xì)胞增殖。然后將板在37℃下孵育2 h。使用EL 800 Absorbance Microplate Reader(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA)在450 nm 波長(zhǎng)的光下測(cè)量光密度。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：細(xì)胞活力(對(duì)照的%)=[(Ae Ab)/(Ac Ab)]100。Ae，Ab和Ac分別代表實(shí)驗(yàn)，空白和對(duì)照組的A450。還通過(guò)上述方法檢測(cè)COS對(duì)細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地一式三份進(jìn)行。用雙激光流式細(xì)胞儀分析凋亡程度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清TIMP-1和MMP-9含量測(cè)定 2組大鼠清液以及血漿樣品進(jìn)行TIMP-1和MMP-9酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組的TIMP-1血漿水平相比，模型組含量上升，在MMP-9的含量檢測(cè)上發(fā)現(xiàn)模型組較對(duì)照組含量升高，2組指標(biāo)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)PCR分析 通過(guò)RT-qPCR分析測(cè)定2組大鼠中TIMP-1和MMP-9 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組TIMP-1和MMP-9 mRNA的表達(dá)上升，炎性反應(yīng)加重，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別MMP-9TIMP-1對(duì)照組82.18±4.2635.43±5.28模型組237.54±1.2783.16±4.36t值5.5274.196P值0.0240.037

組別MMP-9mRNATIMP-1mRNA對(duì)照組1.37±0.011.24±0.23模型組2.37±0.153.05±0.05t值3.3253.766P值0.0030.028

2.3 大鼠炎性因子蛋白表達(dá)情況 通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡，檢測(cè)2組大鼠炎性因子IL-1β和IL-6及TNF-α的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，模型組IL-1β和IL-6及TNF-α的蛋白表達(dá)上升，炎性反應(yīng)加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

組別IL-1βIL-6TNF-α對(duì)照組1.53±0.021.36±0.051.27±0.03模型組3.12±0.172.94±0.032.76±0.18t值3.2564.1771.703P值0.0140.0210.006

2.4 CCL3和CCL4的IHC染色 通過(guò)IHC染色分析2組CCL3和CCL4表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組CCL3和CCL4的表達(dá)上升，炎性反應(yīng)加重，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

組別CCL3CCL4對(duì)照組1.15±0.211.04±0.05模型組3.18±0.042.97±0.02t值2.5274.668P值0.0010.016

2.5 大鼠髓核細(xì)胞凋亡率測(cè)定 用雙激光流式細(xì)胞儀分析2組大鼠細(xì)胞凋亡程度發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組相比細(xì)胞活力降低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表6。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠髓核細(xì)胞凋亡情況

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶參與許多正常的生物過(guò)程(例如胚胎發(fā)育，胚泡植入，器官形態(tài)發(fā)生，神經(jīng)生長(zhǎng)，排卵，宮頸擴(kuò)張，產(chǎn)后子宮復(fù)舊，子宮內(nèi)膜循環(huán)，毛囊循環(huán)，骨重建，傷口愈合，血管生成和細(xì)胞凋亡)和病理過(guò)程(例如關(guān)節(jié)炎，癌癥，心血管疾病，腎炎，神經(jīng)疾病，血腦屏障破壞，牙周病，皮膚潰瘍，角膜潰瘍，肝纖維化，肺氣腫和纖維化肺病)[7-10]。盡管基質(zhì)金屬蛋白酶的主要功能是在組織再吸收和許多疾病的進(jìn)展期間細(xì)胞外基質(zhì)的升高，但顯然基質(zhì)金屬蛋白酶也通過(guò)確定的蛋白水解改變細(xì)胞外基質(zhì)分子的生物學(xué)功能[11]。MMPs被TIMPs的組織抑制劑抵消，其通過(guò)限制細(xì)胞外基質(zhì)分解來(lái)抑制MMP活性。MMP和TIMP之間的平衡在維持健康組織的完整性方面起重要作用[12]。在各種病理狀況中發(fā)現(xiàn)MMP和TIMP的平衡受到干擾，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，癌癥和牙周炎MMP-9和TIMP-1被認(rèn)為通過(guò)溶解細(xì)胞外基質(zhì)參與癌細(xì)胞的傳播，但它們?cè)趧?chuàng)造支持原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的起始和生長(zhǎng)的環(huán)境中也是重要的[13]。MMP-9是屬于鋅依賴(lài)性金屬蛋白酶的酶家族的成員，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起作用[14]。MMP是IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)的下游調(diào)節(jié)劑。MMPs和TIMPs活性的改變以及隨之發(fā)生的MMPs/TIMPs失衡，在動(dòng)物模型中顯示，在動(dòng)脈粥樣硬化，心肌梗死，左心室增生和心力衰竭期間介導(dǎo)病理性重構(gòu)[15]。缺血性心肌病，壓力和體積超負(fù)荷以及神經(jīng)內(nèi)分泌因子如血管緊張素Ⅱ，內(nèi)皮素1，TNF-α和TGF-β可以時(shí)間和細(xì)胞依賴(lài)性方式改變MMPs和TIMPs的表達(dá)，導(dǎo)致MMPs/TIMPs的紊亂心血管組織平衡[16]。

組別細(xì)胞凋亡率對(duì)照組12.44±1.29誘導(dǎo)組56.08±2.37t值2.342P值0.026

在正常健康成人中，MMPs以低水平表達(dá)，并且它們的上調(diào)似乎在許多病理過(guò)程中起重要作用[17]。MMPs活性表達(dá)及對(duì)基質(zhì)蛋白的降解需要一定的外在條件，如白細(xì)胞介素IL-1β和IL-6及腫瘤壞死因子，表皮生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和蛋白水解酶等[18]。引起椎間盤(pán)退變的因素也有很多，如細(xì)胞的衰老，代謝異常造成的分解物積累，營(yíng)養(yǎng)代謝異常等等，這些因素都可加快椎間盤(pán)退變的發(fā)生。椎間盤(pán)自身結(jié)構(gòu)的病變是由基質(zhì)合成與分解的不平衡造成的，MMPs是造成這種不平衡的主要原因[19]。TNF-α MMP家族成員MMP-9參與慢性阻塞性肺病，多發(fā)性硬化癥，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的進(jìn)展。這些影響可能與生長(zhǎng)因子的蛋白水解釋放和細(xì)胞環(huán)境的改變有關(guān)[20]。我們研究了椎間盤(pán)退變大鼠模型中的MMP-9和TIMP-1水平，并將其與對(duì)照組進(jìn)行了比較，還研究了與該疾病相關(guān)的蛋白因子的表達(dá)。研究中最重要的發(fā)現(xiàn)是椎間盤(pán)退變大鼠模型MMP-9和TIMP-1水平之間的關(guān)聯(lián)。此外，高M(jìn)MP-9和TIMP-1水平與某些臨床病理學(xué)變量顯著相關(guān)。筆者認(rèn)為，椎間盤(pán)中,細(xì)胞外基質(zhì)處于不斷地合成和分解的平衡之中,新合成的基質(zhì)分子不斷代替被酶降解的舊分子。這一平衡的破壞,即過(guò)量的 MMPs 的表達(dá)則引起椎間盤(pán)基質(zhì)中 Aggrecan 降解,蛋白多糖含量下降，硫酸軟骨素/硫酸角質(zhì)素比值下降和膠原類(lèi)型發(fā)生明顯改變,造成髓核失水而喪失其固有的彈性，直接導(dǎo)致椎間盤(pán)生物力學(xué)功能的減退甚至喪失,從而出現(xiàn)椎間盤(pán)退變。TIMPs 則可以通過(guò)直接抑制 MMPs 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解來(lái)發(fā)揮延緩椎間盤(pán)退變的作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9和TMP-1可視為椎間盤(pán)退變檢測(cè)的常規(guī)血清生物標(biāo)志物，兩種因子的表達(dá)不平衡會(huì)造成髓核細(xì)胞損害從而引發(fā)椎間盤(pán)退變等疾病發(fā)生，基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子1可做為預(yù)防治療椎間盤(pán)退變疾病的新型靶點(diǎn)。