張莉莉 孫蘇安

我國一直以來為食管癌高發(fā)地區(qū)，近年來隨著人們生活節(jié)奏的加快及飲食結構的改變，食管癌的發(fā)病率明顯增加，主要包括腺癌、鱗癌兩種病理類型，以前者更為多見，預后差。手術仍是可切除食管鱗癌的標準化治療方式，化、放療等為常見輔助治療手段，但高復發(fā)、遠處轉移風險是影響患者預后的主要原因[1]。目前評價腫瘤預后的臨床常規(guī)病理學指標有組織學類型、腫瘤分期、腫瘤體積、轉移情況等，其局限性越來越明顯，尋找新的能夠預測食管癌預后的生物標志物對于指導臨床治療管理具有重要意義[2]。作為腫瘤重要特征，免疫逃逸在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。在眾多免疫因子中，程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1，programmed death-1)與其配體PD-L1通路系腫瘤免疫逃逸中極為關鍵的一環(huán)[3]。已有文獻證實PD-1/PD-L信號通路在多種腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用，如肺癌[4]、卵巢癌[5]、甲狀腺癌[6]、上皮源性惡性腫瘤[7]等。本研究通過免疫組化法明確食管癌組織中PD-1/PD-L1相關蛋白表達情況，并分析其與病理特征及預后的關系，以期為食管癌的預后評估以及治療靶點探討提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我院2012年4月至2014年10月病理科存檔的54例食管癌患者手術切除的癌組織標本，其中42例患者術中取得距離癌組織>5 cm的癌旁組織，病理切片證實沒有癌變。男39例，女15例；年齡36～77歲，平均年齡(54.07±8.56)歲；病變部位：頸或胸上段4例，胃食管交界4例，胸中段28例，胸下段18例；病理類型：腺癌3例，鱗癌51例；按照美國腫瘤聯合會(AJCC，American Association of Cancer)食管癌TNM分期(2010年)[8]確定分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期31例，Ⅲ期9例；有6例發(fā)生遠處轉移。本研究符合醫(yī)院倫理委員會相關要求。隨訪截止日期為2018年10月。

1.2 儀器與試劑 DH4000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，LH50A型倒置相差顯微鏡，恒溫冰箱，免疫組化孵育盒及免疫組化抗原修復盒；兔抗人PD-1抗體、兔抗人PD-L1抗體，DAB試劑盒、SP-9001二抗試劑盒。

1.3 免疫組化檢測PD-1/PD-L1相關蛋白 取54例癌組織與42例癌旁組織石蠟標本，5 μm厚連續(xù)切片，60℃烤箱烤片>2 h，二甲苯中3次(10 min/次)脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5 min。切片放置于塑料染色架，然后浸在pH值6.0的檸檬酸組織抗原緩沖液中，微波適當加熱后取出自然冷卻至室溫。從緩沖液切片以蒸餾水沖洗2次，PBS沖洗3次，每次3 min(下同)。滴加過氧化物酶阻斷劑后于室溫下孵育，10 min后，PBS 洗3次，去除PBS后滴加一抗，然后置于4℃冰箱過夜；次日取出后室溫下復溫，PBS沖洗3次后去除PBS，每張切片滴加生物素標記二抗，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次后去除PBS。接下來繼續(xù)顯色操作，滴加DAB顯色試劑，于顯微鏡下控制顯色時間，觀察3～5 min后(出現棕色本底)自來水沖洗終止顯色，給予蘇木精復原1 min后自來水沖洗反藍。最后進行脫水透明與中性樹膠封片。

1.4 結果判定 陽性結果判定參考文獻[9]，以細胞膜或細胞質出現黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。PD-1/PD-L1陽性表達水平根據染色強度(3分為棕褐色、2分為棕黃色、1分為淡黃色、0分為無著色)與陽性細胞數百分比(隨機選取的5個高倍視野下，1分即陽性細胞率<10%，11%～50%為2分，>50%為3分)共同確定，即二者的乘積>3分為陽性表達，且認為細胞質或細胞膜上、癌細胞或癌間質浸潤淋巴細胞上任一項陽性則結果為陽性表達。癌組織、癌旁組織標本免疫組化切片由2名具備>5年工作經驗的病理科醫(yī)師雙盲獨立觀察。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁組織中PD-1/PD-L1相關蛋白表達情況比較 與癌旁組織比較，癌組織中PD-1、PD-L1蛋白陽性表達率明顯升高(P<0.05)；且癌組織中PD-L1蛋白陽性表達率顯著高于PD-1(P<0.05)。PD-L1主要表達于腫瘤細胞與部分間質細胞，PD-1則均表達于腫瘤浸潤性淋巴細胞。見表1，圖1。

表1 癌組織、癌旁組織中PD-1/PD-L1相關蛋白表達情況比較 例(%)

注：癌組織PD-1、PD-L1蛋白陽性表達率比較(χ2=4.558，P=0.033)

2.2 PD-1/PD-L1相關蛋白表達與病理特征的關系 PD-1蛋白、PD-L1蛋白表達與食管癌患者年齡、性別、病變部位、病理類型無關(P>0.05)，與TNM分期明顯相關(其P<0.05)，且PD-L1蛋白表達還與遠處淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)。見表2。

圖1 癌組織中PD-1、PD-L1(蛋白免疫組化染色×200)；A、B分別為PD-1蛋白陽性、陰性表達；CD分別為PD-L1蛋白陽性、陰性表達

表2 PD-1/PD-L1相關蛋白表達與病理特征的關系 例(%)

2.3 預后分析 隨訪36～48個月。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，PD-1陽性、陰性表達者中位無病生存期(DFS，disease-free survival)分別為13個月(95%CI：9.5～16.0)、15個月(95%CI：9.8～18.1)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而PD-L1陽性、陰性表達者中位DFS分別為10個月(95%CI：7.6～13.7)、19個月(95%CI：16.9～21.9)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Cox回歸模型分析表明，僅TNM分期、遠處轉移以及PD-L1蛋白高表達是食管癌不良預后的獨立因素(P<0.05)。見表3，圖2～3。

表3 影響影響食管癌DFS的單/多因素分析

3 討論

近年來，臨床腫瘤治療對免疫檢查點抑制劑的應用上升到了新的高度，且免疫共刺激分子也成為免疫學研究的熱點之一。其中PD-1/PD-L信號通路可通過抑制T細胞的活化致使腫瘤免疫耐受，故有學者提出阻斷這一信號通路可能會誘導T細胞活化并殺傷腫瘤細胞[10]。PD-1/PD-L相關蛋白中，作為免疫球蛋白CD28超家族的成員，PD-1是一種抑制性的協(xié)同刺激分子，常常表達于激活后的B細胞、T細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷性T細胞、激活的單核細胞及部分樹突狀細胞等。PD-1具有在T細胞外周效應器活化的階段抑制T細胞免疫檢查點，并引起其配體PD-L1及PD-L2的細胞的免疫耐受。有研究顯示，PD-1可以通過下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR、AKT、S6、ERK2等的磷酸化和上調10號染色體缺失的相關基因而實現促進CD25調節(jié)性T細胞產生、維持的目的，進而可明顯抑制效應性T細胞發(fā)揮作用[11]。PD-L1是實體瘤中表達的主要PD-1配體，又屬于I型穿膜蛋白，常表達于B細胞、T細胞、間質干細胞、巨噬細胞、部分樹突狀細胞以及骨髓源性肥大細胞等。

圖2 PD-1蛋白表達與食管癌DFS的關系

圖3 PD-L1蛋白表達與食管癌DFS的關系

就分子機制而言，PD-L1只有表達在細胞膜上時才有生物學活性，能通過改變炎性介質干擾素-γ表達及激活致癌基因而達到其生物學效應[12]。有研究顯示，癌細胞中PD-L1分子表達的上調可以促使其轉移和浸潤，且使腫瘤細胞能夠躲過CD8 T細胞的攻擊，從而逃逸機體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)[13]。張風賓等[14]報道指出，PD-L1與B細胞上的PD-1結合后可以促使PD-1胞質區(qū)免疫受體酪氨酸轉換機制結構域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化及信號分子Igα/β、Syk發(fā)生去磷酸化，繼而免疫抑制信號得以傳遞，最終使腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視。

本研究分析食管癌組織中PD-1/PD-1相關蛋白表達情況，與病理參數的關系以及對預后的影響，通過免疫組化法檢測PD-1蛋白、PD-L1蛋白的表達，發(fā)現與癌旁組織比較，癌組織中PD-1及PD-L1蛋白陽性表達率皆明顯高(46.30% vs 9.52%，66.67% vs 16.67%)，且癌組織中PD-L1蛋白陽性表達率顯著高于PD-1，這與韓向前等[15]結果類似，但該研究僅分析了食管癌組織PD-L1表達比正常食管組織高，并與浸潤深度(T分期)緊密相關。吳圣等[16]報道顯示PD-L1、PD-1在胃癌細胞、癌間質淋巴細胞表達較癌旁組織顯著升高，且兩種蛋白陽性率有差異(陽性率分別為38.41%、60.93%)，與本研究較為符合，但該研究中組織標本為胃癌。而Chen等[17]162例食管癌標本進行免疫組化檢測，發(fā)現PD-L1表達水平顯著高于周圍正常上皮組織。另外，有報道對PD-1/PD-L1相關蛋白在腫瘤細胞表達的部位進行分析，發(fā)現食管癌組織的胞膜、胞核、胞漿皆有PD-L1蛋白表達，且表達水平與腫瘤浸潤深度顯著相關，而PD-1蛋白多局限于腫瘤浸潤性淋巴細胞表達[18]，與本文免疫組化結果一致，結合兩種蛋白的陽性表達情況，推測PD-L1與食管腫瘤的浸潤深度或預后密切相關，而PD-1的相關性可能不明顯。

本研究進一步進行病理特征與術后隨訪分析，發(fā)現PD-1蛋白及PD-L1蛋白表達與食管癌TNM分期明顯相關，且PD-L1蛋白表達還與遠處淋巴結轉移明顯相關。同時，生存曲線分析顯示，PD-1陽性、陰性表達者中位DFS無明顯差異，而PD-L1陽性表達者中位DFS明顯較陰性表達者縮短，且Cox回顧分析證實僅TNM分期、遠處轉移及PD-L1蛋白高表達是食管癌不良預后的獨立因素，PD-1對預后的影響不突出，證實了前文推測。事實上，已有學者分析指出，PD-Ll與CD8 T細胞浸潤程度呈明顯正相關，而CD8 T細胞對腫瘤細胞起著直接殺傷作用，因此，PD-Ll的作用并不直接導致細胞凋亡，但可通過減少T細胞的增殖與存活促使腫瘤進展、惡化，而PD-1的這一生物學效應不明顯[19]。Ohigashi等[20]通過聚合酶鏈式反應檢測食管癌組織中PD-L1 mRNA表達，發(fā)現表達水平高者預后差，并證實PD-L1 mRNA表達水平是食管癌的獨立預后因素。文松等[21]報道證實PD-Ll細胞通常提示免疫細胞浸潤，食管鱗癌組織中PD-Ll蛋白陽性表達往往預示著較差的預后。

綜上所述，食管癌中PD-1/PD-L1相關蛋白陽性表達與病理特征以及預后密切相關，建議條件允許的情況下對食管癌患者進行PD-L1、PD-1檢測，尤其是對于PD-L1蛋白高表達者可考慮應用PD-L1抑制劑，但其是否能改善預后仍有待進一步證實，且PD-1/PD-L1相關蛋白檢測方法、試劑及預后評判標準可能影響結果，相關結論仍需擴大樣本量、多中心的研究論證。