景曉莉

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力增大等原因，胃癌漸呈年輕化趨勢[1]。胃癌早期癥狀不顯著，易被錯誤認為胃炎、胃潰瘍等疾病，貽誤最佳治療時期[2]。當前胃癌發(fā)生發(fā)展機制尚不完全明了，遠期預后往往不佳，因此尋求評估胃癌進展與預后的新指標對胃癌的免疫治療具有重要臨床價值。近年來，細胞衰老作為根治惡性腫瘤的靶標已受到廣泛關(guān)注，研究表明，Cbx4可通過抑制細胞衰老促進肝細胞癌進展[3]，但Cbx4在胃癌中筆者未見研究。FRMD4A包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域，包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域的蛋白與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，然而FRMD4A在胃癌中研究較少。本研究通過觀察胃癌組織及其癌旁組織Cbx4、FRMD4A表達差異，探討Cbx4、FRMD4A與臨床病理關(guān)系及其預后的關(guān)系，以期為胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月至2016年4月于我院進行手術(shù)治療的85例胃癌患者胃癌組織標本作為胃癌組，另選取距癌組織邊緣>5 cm的對應(yīng)癌旁組織標本為癌旁組織組?；颊呔?jīng)病理證實為胃癌。其中男52例，女33例；年齡41～75歲，平均年齡(56.21±4.92)歲。收集臨床病理資料，包括腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織分化程度、浸潤深度等。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象對本研究知情同意且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①胃癌患者均經(jīng)手術(shù)病理證實；②術(shù)前未進行化療、放療及激素治療者；③病灶無明顯壞死區(qū)。

1.2.2 排除標準：①自身免疫性疾病者；②具有明顯炎癥細胞浸潤癌旁組織；③合并其他惡性腫瘤者；④臨床資料不完整者。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantification PCR，qRT-PCR)檢測Cbx4、FRMD4A mRNA表達:采用qRT-PCR法檢測胃癌組織及癌旁組織中Cbx4、FRMD4A mRNA 相對表達量。應(yīng)用TRI試劑提取胃癌組織及其癌旁組織標本RNA，通過Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR反應(yīng)體系共為50 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，內(nèi)參照上游引物下游引物各0.5 μl，dNTP 0.5 μl Taq酶1 μl，待測樣本cDNA 5 μl，ddH2O 32.5 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，引物通過生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min；(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個循環(huán)。Cbx4、FRMD4A均以GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt算法[7]計算Cbx4、FRMD4A mRNA相對表達量。試驗重復3次，取平均值。見表1。

表1 引物序列

1.3.2 免疫組化法檢測Cbx4、FRMD4A蛋白表達:嚴格按照試劑盒說明書進行操作，3,3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色液進行顯色反應(yīng)，采用蘇木素復染并將其在不同梯度乙醇中脫水，中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。2位具有豐富臨床經(jīng)驗醫(yī)師做雙盲閱片，以細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽性反應(yīng)，在200倍光鏡下觀察結(jié)果并從每個切片中選取10個高倍視野中隨機挑選并對陽性染色細胞數(shù)量進行統(tǒng)計。利用IP評分進行結(jié)果判讀：①染色強度，細胞無染色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。②陽性細胞數(shù)，染色細胞數(shù)<10% 0分；染色細胞數(shù)10%～30% 1分；染色細胞數(shù) 31%～60% 2分；染色細胞數(shù)>60% 3分。兩項計分結(jié)果相乘，>2分為陽性，<2分為陰性。

1.3.3 隨訪：患者出院后通過電話、郵件及上門隨訪方法觀察生存情況，終止日期為2019年4月。

2 結(jié)果

2.1 Cbx4、FRMD4A mRNA表達情況 與癌旁組織相比，胃癌組織中Cbx4、FRMD4A mRNA表達均顯著升高(P<0.05)。見表2。

組別Cbx4/GAPDHFRMD4A/GAPDH癌旁組1.01±0.200.64±0.15胃癌組1.37±0.231.22±0.21t值10.88920.721P值<0.001<0.001

2.2 胃癌組織及癌旁組織中Cbx4、FRMD4A蛋白表達情況 鏡下觀察，Cbx4定位于細胞核與細胞漿中，呈棕黃色顆粒狀。FRMD4A陽性表達主要位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，胃癌組織中陽性表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。與癌旁組相比，胃癌組Cbx4、FRMD4A蛋白陽性表達率均升高(P<0.05)。見表3，圖1。

2.3 Cbx4、FRMD4A蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 Cbx4、FRMD4A表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小差異均無關(guān)(P>0.05)；Cbx4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度為T3～ T4、病理分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低患者中陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T1～ T2、病理分期Ⅰ～Ⅱ期、分化程度中高度患者(P<0.05)。FRMD4A蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度為T3～ T4、病理分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低患者中陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T1～ T2、病理分期Ⅰ～Ⅱ期、分化程度中高度患者(P<0.05)。見表4。

表3 2組Cbx4、FRMD4A蛋白表達情況 n=85

圖1 Cbx4、FRMD4A蛋白表達情況(SP×200);A 癌旁組織Cbx4蛋白陰性表達；B 胃癌組織Cbx4蛋白陽性表達；C 癌旁組織FRMD4A弱陽性表達；D 胃癌組織FRMD4A陽性表達

2.4 胃癌組織中Cbx4、FRMD4A表達與預后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示，Cbx4陽性表達患者的總生存率顯著低于Cbx4陰性表達者(27.5% vs 76.5%，P<0.05)，F(xiàn)RMD4A陽性表達者的總生存率顯著低于FRMD4A陰性表達者(23.4% vs 76.3%，P<0.05)。見圖2。

2.5 胃癌預后危險因素分析 單因素COX分析顯示，性別、年齡、TNM分期、分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、Cbx4、FRMD4A均是影響胃癌預后的危險因素(P<0.05)；多因素COX分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸潤深度T3～ T4、Cbx4陽性表達、FRMD4A陽性表達是影響胃癌患者不良預后的獨立危險因素(HR=1.575，2.491，1.575，3.709，3.691，P<0.05)。見表5。

表4 Cbx4、FRMD4A表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中胃癌發(fā)病率居首位，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，患者趨于年輕化。Cbx4屬于PcG家族成員，有研究表明Cbx4在大腸癌、肝癌癌組織中高表達[5-7]，但在胃癌中則較少。FRMD4A是近年來被克隆鑒定的新基因，F(xiàn)RMD4A基因表達產(chǎn)物FRMD4A蛋白是一類擁有FRMD結(jié)構(gòu)域的蛋白，F(xiàn)RMD結(jié)構(gòu)域具有調(diào)控細胞骨架，參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的功能[8]。FRMD4A在鱗狀細胞癌中高表達，但在胃癌中研究較少。

圖2 胃癌組織中Cbx4、FRMD4A表達與預后的關(guān)系；左為Cbx4表達與預后的關(guān)系；右為FRMD4A表達與預后的關(guān)系

表5 胃癌患者預后影響因素分析

細胞衰老是指細胞周期無法進入S期啟動染色質(zhì)復制完成增殖活動的過程，衰老細胞可被免疫細胞清除，是腫瘤發(fā)生過程中的天然屏障[9]。多梳家族蛋白(polycomb group，PcG)表達失調(diào)可造成多種惡性腫瘤，并可調(diào)節(jié)細胞衰老[10,11]。Cbx4基因是一個特殊的PcG蛋白，定位于17號染色體17q25.3，屬于PRC1復合物組分之一，而PRC1是PcG蛋白的主要成分之一[12]。Li等[13]研究表明，Cbx4可通過提高HIF-1α表達，增強低氧誘導的血管內(nèi)皮生長因子表達，并促進血管生成，從而促進肝細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Zeng等[14]研究表明，Cbx4可促進乳腺癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究中，胃癌組織中Cbx4 mRNA表達顯著高于其癌旁組織，免疫組化法結(jié)果顯示胃癌組Cbx4蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織組，提示Cbx4在胃癌組織中高表達，可能與胃癌的發(fā)生具有一定關(guān)系。進一步分析顯示，Cbx4蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、病理分期、分化程度等密切相關(guān)。另外，Cbx4陽性表達者3年內(nèi)總生存率顯著低于Cbx4陰性表達者，提示Cbx4陽性表達可能影響患者生存時間，不利于胃癌患者預后。進一步研究表明，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度T3～ T4、分化程度低、Cbx4陽性表達是患者預后不良的獨立危險因素，提示對于術(shù)后胃癌患者，檢測Cbx4蛋白表達水平結(jié)合TNM分期、浸潤深度、分化程度可能更準確地評估患者預后，優(yōu)化治療方法。

FRMD4A基因位于人染色體10p13，編碼的FRMD4A蛋白屬于FERM超家族成員，擁有FERM結(jié)構(gòu)域，而含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-17]。目前對FRMD4A研究較少，通常參考其他具有FERM結(jié)構(gòu)域蛋白的研究進行了解。Goldie等[18]研究表明，在人鱗狀細胞癌中FRMD4A高表達。本研究胃癌組織中FRMD4A mRNA表達顯著高于其癌旁組織，免疫組化試驗顯示FRMD4A蛋白在胃癌組織中陽性表達率高于癌旁組織，提示FRMD4A表達與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。FRMD4A陽性表達率隨TNM分期、浸潤深度升高、病理分期升高、向低分化發(fā)展、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，提示FRMD4A表達與臨床病理特征密切相關(guān)。生存分析顯示，F(xiàn)RMD4A陽性表達者3年內(nèi)總生存率顯著低于FRMD4A陰性表達者，進一步研究表明，F(xiàn)RMD4A陽性表達亦是胃癌不良預后的獨立危險因素之一，提示檢測FRMD4A表達對胃癌預后評估具有一定參考價值。

綜上所述，胃癌組織中Cbx4、FRMD4A高表達，二者與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關(guān)，檢測Cbx4、FRMD4A表達對預后判斷等具有一定臨床意義。