王月 黃冬梅 張永紅 雷鳳

急性心肌梗死是一種嚴(yán)重的缺血性心臟病，可導(dǎo)致心律失常、心力衰竭等多種預(yù)后不良的并發(fā)癥。患者一般具有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)，在激動(dòng)、過勞、暴飲暴食、寒冷等因素的刺激下，可導(dǎo)致粥樣斑塊破裂、血栓形成或動(dòng)脈痙攣，從而誘發(fā)心肌梗死的發(fā)生[1]。盡快實(shí)施經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)是治療急性心肌梗死的有效方法，但是快速的循環(huán)重建會(huì)不可避免的導(dǎo)致心肌細(xì)胞受到缺氧復(fù)氧損傷[2]。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧復(fù)氧損傷的病理機(jī)制可能包括炎癥的級(jí)聯(lián)擴(kuò)大、氧化應(yīng)激失衡、脂質(zhì)的過氧化、鈣離子的過載、心肌細(xì)胞的凋亡與自噬等[3]，但是部分病理過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚不明確，可能是目前治療研究結(jié)果并不理想的主要原因。Paralemmin-3(PALM3)是Paralemmin蛋白家族的成員之一，在1992年首次于非洲爪蛙中發(fā)現(xiàn)，可能作為中間分子參與調(diào)節(jié)Toll樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor，TIR)信號(hào)通路[4,5]。Chen等[6-8]發(fā)現(xiàn)，PALM3可以與單免疫球蛋白白介素-1受體相關(guān)蛋白(single immunoglobulin IL-1 receptor-related molecule，SIGIRR)的羧基端相互結(jié)合，抑制SIGIRR的表達(dá)，而SIGIRR是TIR信號(hào)通路中關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子。抑制PALM3的表達(dá)可減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，可能與上調(diào)SIGIRR表達(dá)，從而抑制TIR信號(hào)通路有關(guān)[9,10]。TIR信號(hào)通路也參與缺氧復(fù)氧損傷的炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大[11,12]，但是PALM3在其中的作用尚不清楚。因此，本文探討PALM3在缺氧復(fù)氧致心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化，并且使用RNA干擾技術(shù)沉默PALM3表達(dá)，以研究其在缺氧復(fù)氧損傷中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大鼠H9c2細(xì)胞購置于中科院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購置于美國Gibco公司；靶向序列與引物序列合成于上海生物工程有限公司；LipofectamineTM 2000購置于美國Invitrogen公司；BamHⅠ酶、HindⅢ酶、Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購置于日本Takara公司；pGenesil-1.1質(zhì)粒購于武漢晶賽生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；MTT、二甲基亞砜購于美國Sigma公司；一抗均購于英國Abcam公司；二抗均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每2天換液一次，待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%左右時(shí)，使用0.25 g/L的胰酶消化傳代，使用第3～4代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 根據(jù)Chen等[7]報(bào)道將5’-AGATCTTGATGGAGGGTTT-3’作為靶向序列，合成PALM3的干擾RNA(siRNA-PALM3)和對(duì)照序列(siRNA-Control)。將單鏈寡核苷酸片段退火成雙鏈，使用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等基因工程的方法將其構(gòu)建至pGenesil-1.1質(zhì)粒的BamHⅠ酶切位點(diǎn)和HindⅢ酶切位點(diǎn)間。使用LipofectamineTM 2000將測序正確的siRNA-PALM3質(zhì)粒和siRNA-Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞。見表1。

表1 干擾RNA的序列

1.4 缺氧復(fù)氧損傷模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道構(gòu)建缺氧復(fù)氧損傷模型，具體步驟：待細(xì)胞融合至85%左右時(shí)，用無菌的PBS洗滌2～3次，盡可能地除去培養(yǎng)基。加入缺氧液，即經(jīng)95% N2和5% CO2的混合氣體飽和30 min的DMEM培養(yǎng)基(無血清)，放入37℃培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入95% N2和5% CO2的混合氣體，在該缺氧環(huán)境中培養(yǎng)4 h。然后更換為復(fù)氧液，即經(jīng)95%空氣和5% CO2的混合氣體飽和30 min的DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，放于37℃培養(yǎng)箱中，在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4 h，以模擬復(fù)氧環(huán)境。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、模型組、siRNA-Control組、siRNA-PALM3組。對(duì)照組使用未進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷的正常細(xì)胞；模型組使用進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷的細(xì)胞；siRNA-Control組使用siRNA-Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷；siRNA-PALM3組使用siRNA-PALM3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB) 構(gòu)建模型處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入含PMSF的蛋白質(zhì)裂解液，充分裂解后，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量。按照聚丙烯酰胺凝膠試劑盒配制濃縮膠和分離膠，向樣品孔中加入30 μg的總蛋白，跑膠結(jié)束后，將目的蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。使用5%的牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗在4℃孵育過夜，稀釋比例：抗PALM3抗體為1∶1 000、抗NF-κB抗體為1∶2 000、抗SIGIRR抗體為1∶1 000、抗GAPDH抗體為1∶5 000。洗滌3次后，加入二抗于37℃孵育1 h，二抗稀釋比例為1∶5 000，洗滌3次，使用ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像儀曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值，將對(duì)照組的目的蛋白相對(duì)表達(dá)量作為1，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒檢測PALM3的表達(dá)量。使用ABI 7 500型定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s、62℃ 45 s、72℃ 2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將反應(yīng)產(chǎn)物加入到瓊脂糖凝膠的樣品孔中，跑膠結(jié)束后，凝膠成像儀曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=目的基因的灰度值/GAPDH基因的灰度值，將對(duì)照組的目的基因相對(duì)表達(dá)量作為1，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。見表2。

表2 引物序列

1.8 免疫熒光染色 處理結(jié)束后，用4℃預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞30 min，山羊血清封閉20 min，加入稀釋后的抗PALM3抗體4℃過夜孵育，稀釋比例為1∶100。次日，洗滌后加入FITC標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，二抗稀釋比例為1∶200，洗滌后，用DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察和拍照。每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)非重疊的視野(200×)進(jìn)行拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件測定綠色熒光的光密度值，將對(duì)照組的光密度值作為1，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 MTT試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞按照每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放于37℃培養(yǎng)箱中，在正常條件下培養(yǎng)至匯合度為85%左右，各組按照上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染和缺氧復(fù)氧損傷。處理結(jié)束后每孔加入20 μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入150 μl的二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm處測定各孔的吸光度值(OD)。計(jì)算細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組的OD值-空白孔的OD值)/(對(duì)照組的OD值-空白孔的OD值)×100%。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 處理結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)試劑盒的說明書測定上清液中白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞中PALM3表達(dá)比較 與對(duì)照組相比較，模型組和siRNA-Control組細(xì)胞中PALM3 mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)量和相對(duì)熒光強(qiáng)度均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組相比較，siRNA-PALM3組細(xì)胞中PALM3 mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)量和相對(duì)熒光強(qiáng)度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 細(xì)胞中PALM3表達(dá)的檢測；A：qRT-PCR檢測PALM3 mRNA的表達(dá)；B：WB檢測PALM3蛋白質(zhì)的表達(dá)；C：免疫熒光染色檢測PALM3蛋白質(zhì)的表達(dá)(200×)

組別mRNA蛋白質(zhì)相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)照組1.00±0.171.00±0.181.00±0.23模型組4.21±0.69?3.85±0.58?4.77±0.80?siRNA-Control組4.08±0.62?3.92±0.55?4.61±0.89?siRNA-PALM3組0.93±0.19#△1.04±0.20#△0.91±0.26#△ F值145.800153.900119.900 P值<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-Control組比較，△P<0.05

2.2 4組細(xì)胞間存活率及上清液中炎性因子含量比較 與對(duì)照組比較，模型組、siRNA-Control組和siRNA-PALM3組的細(xì)胞存活率均降低，上清液中IL-1β和TNF-α的含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組比較，siRNA-PALM3組的細(xì)胞存活率升高，上清液中IL-1β和TNF-α的含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別存活率(%)IL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)對(duì)照組100.00±9.3836.04±4.17326.59±29.04模型組43.26±7.50?95.22±10.83?571.80±70.66?siRNA-Control組41.89±8.66?93.27±9.50?582.14±73.02?siRNA-PALM3組78.32±10.51?#△53.11±7.94?#△414.65±62.49?#△ F值97.310121.10041.140 P值<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-Control組比較，△P<0.05

2.4 4組細(xì)胞中NF-κB表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組、siRNA-Control組和siRNA-PALM3組細(xì)胞中NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組比較，siRNA-PALM3組細(xì)胞中NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 WB檢測NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)

組別NF-κBSIGIRR對(duì)照組1.00±0.191.00±0.24模型組3.88±0.36?0.42±0.17?siRNA-Control組3.95±0.39?0.47±0.20?siRNA-PALM3組1.92±0.24?#△0.77±0.23?#△ F值229.20016.450 P值<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-Control組比較，△P<0.05

2.5 4組細(xì)胞中SIGIRR表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組、siRNA-Control組和siRNA-PALM3組細(xì)胞中SIGIRR蛋白質(zhì)的表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組相比較，siRNA-PALM3組細(xì)胞中SIGIRR蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

PALM3是TIR信號(hào)通路中新發(fā)現(xiàn)的一種接頭分子，具體的生物學(xué)作用尚不清楚，但是初步的研究顯示，可能類似于髓樣細(xì)胞分化蛋白88(Myeloid differential protein 88，MyD88)、白介素1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)等接頭分子，用于傳遞上游TLR的信號(hào)，并且激活下游NF-κB，從而參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[8,9]。Li等[9]使用脂多糖誘導(dǎo)以肺部炎癥為主要病理表現(xiàn)的急性肺損傷動(dòng)物模型中，PALM3呈明顯的高表達(dá)，通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制PALM3的表達(dá)，可顯著降低支氣管肺泡灌洗液中炎性因子的含量以及中性粒細(xì)胞的比例，抑制毛細(xì)血管通透性的升高，提高小鼠的生存率，表明PALM3可能是炎癥調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵分子。但是目前為止，關(guān)于PALM3的研究時(shí)間較短，除了脂多糖的致炎模型外，其表達(dá)及具體作用機(jī)制尚未在其他炎性疾病中得到證實(shí)。

圖3 WB檢測SIGIRR蛋白質(zhì)的表達(dá)

炎癥的級(jí)聯(lián)擴(kuò)大是缺氧復(fù)氧損傷的主要病理機(jī)制，而PALM3是否參與其中尚不清楚。因此，本文首先根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，模擬了缺氧和復(fù)氧的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，成功構(gòu)建了缺氧復(fù)氧致心肌細(xì)胞損傷的模型，表現(xiàn)為細(xì)胞生存率的降低、上清液中IL-1β和TNF-α含量的升高、NF-κB的高表達(dá)。然后，分別使用qRT-PCR和WB從基因和蛋白質(zhì)兩個(gè)方面，證實(shí)PALM3在在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中呈高表達(dá)，而且免疫熒光染色結(jié)果顯示，PALM3主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。

本文參照Chen等[7]的報(bào)道，設(shè)計(jì)合成了RNA干擾序列，并成功構(gòu)建至pGenesil-1.1質(zhì)粒中，對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，PALM3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量均顯著降低，表明此干擾序列的沉默效果較好，與Chen等[7]使用慢病毒載體進(jìn)行RNA干擾的報(bào)道相一致。質(zhì)粒作為小干擾RNA載體雖然沉默效果可能不如慢病毒、腺病毒等載體，但是具有簡單、方便的優(yōu)勢，而且本文的研究目的是初步探討PALM3的作用，僅使用體外細(xì)胞模型進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，質(zhì)粒作為載體已經(jīng)能達(dá)到較好的沉默效果，但是在以后使用心臟缺血再灌注損傷動(dòng)物模型時(shí)，可能需要構(gòu)建病毒載體，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率和沉默效果。

為了研究PALM3的沉默是否對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，我們分別對(duì)細(xì)胞存活率、炎癥因子的釋放以及NF-κB的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示與模型組和siRNA-Control組相比較，siRNA-PALM3組細(xì)胞的存活率升高，上清液中IL-1β和TNF-α的含量均降低，NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低。缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致細(xì)胞生存率降低的原因較多，其中高炎癥水平是主要原因之一，大量釋放的炎性因子可以激活細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)死亡受體信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)與匯聚[14]，因此沉默PALM3使細(xì)胞生存率上調(diào)的原因可部分歸功于對(duì)NF-κB炎癥通路及炎性因子釋放的抑制作用。

為了進(jìn)一步研究沉默PALM3對(duì)NF-κB介導(dǎo)炎癥的抑制機(jī)制，需要對(duì)NF-κB上游接頭分子的表達(dá)情況進(jìn)行分析。在細(xì)胞受到缺氧復(fù)氧的外界刺激時(shí)，可激活TLR介導(dǎo)的免疫防御通路，通過活化MyD88、IRAK、TRAF6等接頭分子促進(jìn)IκB(Inhibitor of kappa B)磷酸化，磷酸化的IκB與NF-κB解離，使NF-κB入核上調(diào)炎性因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，SISIRR可與MyD88、IRAK、TRAF6等分子相互作用，從而在上述炎癥信號(hào)通路中發(fā)揮抑制作用[16]。我們對(duì)SISIRR進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，沉默PALM3可以上調(diào)SIGIRR的表達(dá)，可能是NF-κB表達(dá)及炎性因子分泌受到抑制的主要原因。Chen等[8]使用免疫共沉淀等方法也證實(shí)了PALM3與SIGIRR間存在直接的相互作用，進(jìn)一步支持了本文的結(jié)論。

本文的局限性：(1)研究發(fā)現(xiàn)，PALM3作為接頭分子還可以與TIR信號(hào)通路中其他分子發(fā)生相互作用，包括IRAK-1、TIACM-2、TRAF-6等[6]，但是本文未對(duì)這些分子的表達(dá)情況進(jìn)行檢測；(2)本文僅使用了缺氧復(fù)氧的體外細(xì)胞模型，未構(gòu)建心臟缺血后再灌注損傷動(dòng)物模型，以進(jìn)一步探討PALM3的表達(dá)變化，以及敲低PALM3是否具有保護(hù)作用。

綜上所述，在缺氧復(fù)氧損傷中，PALM3的表達(dá)顯著升高，使用RNA干擾沉默PALM3的表達(dá)，可以提高細(xì)胞的存活率，降低炎癥因子的分泌和NF-κB的表達(dá)，可能與促進(jìn)SIGIRR的表達(dá)有關(guān)。