白春俠 李晗 劉麗 崔冬梅 衛(wèi)廣輝

結(jié)直腸癌是常發(fā)生在大腸的惡性上皮性腫瘤，90%的結(jié)直腸癌患者是腺癌，近年來相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌患者發(fā)病人數(shù)和病死率，逐年增加，對人們的身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅[1,2]。腫瘤患者發(fā)病的過程受多種基因、因素等影響，是一個(gè)較復(fù)雜的過程，研究指出，結(jié)直腸癌發(fā)病過程，會(huì)導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)差異，因?yàn)槠涔δ懿煌?，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及生物學(xué)行為產(chǎn)生影響[3]。目前臨床中關(guān)于結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，對患者及早進(jìn)行診斷和治療，對患者來說具有積極意義。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因(TMSG-1)屬于一種新型的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，主要是從前列腺癌細(xì)胞系克隆產(chǎn)生，主要存在于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體中。相關(guān)研究指出，通過體外實(shí)驗(yàn)，TMSG-1對人前列腺癌、乳腺癌等細(xì)胞的生長以及克隆產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)抑制細(xì)胞的侵襲作用[4,5]。Ki-67作為一種核蛋白質(zhì)，與細(xì)胞增殖活性有關(guān)。孫旭凌等[6]研究指出，Ki-67是一種細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在腫瘤分化、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。Pgp1是一種細(xì)胞膜跨膜糖蛋白，對正常細(xì)胞異物發(fā)揮藥泵作用，張全武等[7]指出，Pgp1表達(dá)與癌癥患者的耐藥以及預(yù)后有緊密的聯(lián)系。本文旨在研究結(jié)直腸癌患者TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)及臨床病理特征相關(guān)性，為臨床診斷結(jié)直腸癌提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月至2018年7月在我院就診的結(jié)直腸癌患者30例，其中男18例，女12例；年齡28～60歲，平均年齡(40.6±3.2)歲。其中直腸癌20例，結(jié)腸癌10例；根據(jù)癌病理分化程度分低分化12例，中分化10例；高分化8例；浸潤深度分黏膜下13例，漿膜下7例，漿膜外10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期15例，Ⅲ+Ⅳ期15例。選取在我院普外科行活檢患者30例，其中男15例，女15例；年齡28～65歲，平均年齡(43.4±3.0)歲。2組患者年齡和性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)病理學(xué)進(jìn)行確診；所有患者有結(jié)直腸癌手術(shù)史。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行過化療患者；合并其他腫瘤患者；患有其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病患者；精神障礙患者；妊娠期女性；病歷資料不全患者。本研究患者及家屬均知情，有簽署知情通知書。

1.3 主要試劑 PBS溶液、DAB顯色、蛋白酶修復(fù)液(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Tris-HCl緩沖液、枸櫞酸溶液(購自武漢博士德生物工程有限公司)；Na2HPO4、鄰苯二胺(購自天根生化科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集：取結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除癌組織標(biāo)本，制作的組織標(biāo)本采用40 g/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 μm，連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記。正常結(jié)腸黏膜組織，通過活檢取塊進(jìn)行制作標(biāo)本。采集患者血液樣本，使用轉(zhuǎn)速2 000 r/min的離心機(jī)，離心處理20 min，分離血清，放入潔凈的EP試管中，在-20℃環(huán)境中保存，待用。

1.4.2 免疫組化：將石蠟切片樣本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度乙醇水化；加入蛋白酶修復(fù)液，在37℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復(fù)液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的H2O2，去過氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用PBS淋液沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環(huán)境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS淋液沖洗；經(jīng)過DAB顯色處理10 min，在顯微鏡下觀察陽性反應(yīng)，之后脫水并封片處理。

1.4.3 TMSG-1、Ki-67、Pgp1檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行，取包被液適當(dāng)稀釋的抗TMSG-1、Ki-67、Pgp1 0.1 ml，添加至聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，加蓋后溫度4℃ 24 h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH值7.4，0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標(biāo)本0.1 ml，同時(shí)加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，在43℃置60 min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入TMSG-1、Ki-67、Pgp1的酶標(biāo)抗體0.1 ml，43℃置60 min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個(gè)空中加入底物液(0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml,0.05 mol/L枸櫞酸(10.5 g/L)4.86 ml混勻,加入鄰苯二胺0.1 ml，置黑20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。分析TMSG-1、Ki-67、Pgp1水平。

2 結(jié)果

2.1 TMSG-1、Ki-67、Pgp1在結(jié)直腸癌患者組織中的陽性表達(dá)比較 與正常結(jié)腸黏膜組織相比，癌旁組織和癌組織組TMSG-1、Ki-67、Pgp1陽性表達(dá)較高，癌組織組TMSG-1、Ki-67、Pgp1陽性表達(dá)高于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌病理分化程度的關(guān)系 結(jié)直腸癌低分化TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)高于中分化和高分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 TMSG-1、Ki-67、Pgp1在3組患者組織中的陽性表達(dá)比較 n=30,例(%)

a1 b2 c1 a2 b2 c2 a3 b3 c3

TMSG-1(免疫組化×200) Ki-67(免疫組化×200) Pgp1(免疫組化×200)

圖1 TMSG-1、Ki-67、Pgp1在結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)；a正常結(jié)腸黏膜組織；b癌旁組織組；c癌組織組

表2 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌病理分化程度的關(guān)系 例(%)

2.3 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌浸潤深度的關(guān)系 結(jié)直腸癌漿膜下浸潤TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)高于黏膜下和漿膜外，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌浸潤深度的關(guān)系 例(%)

2.4 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 結(jié)直腸癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 例(%)

2.5 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌TNM分期的關(guān)系 Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 TMSG-1、Ki-67、Pgp1與結(jié)直腸癌TNM分期的關(guān)系 例(%)

2.6 TMSG-1、Ki-67、Pgp1之間相關(guān)性研究 TMSG-1、Ki-67、Pgp1之間進(jìn)行相關(guān)性分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TMSG-1與Ki-67之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.581,P=0.000)，TMSG-1與Pgp1之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.372,P=0.039)，Ki-67與Pgp1之間呈正相關(guān)(r=0.510,P=0.004)。見圖2。

3 討論

結(jié)直腸癌目前臨床手術(shù)治療，患者5年生存率為50%～70%，并且患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，通過放療和化療能夠延長患者的生存時(shí)間[8]。目前臨床中關(guān)于結(jié)直腸癌患者的發(fā)病機(jī)制并沒有明確，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究不斷深入，醫(yī)學(xué)事業(yè)不斷發(fā)展，分子靶向藥物治療在癌癥患者治療中發(fā)揮著重要作用[9]。因此臨床中中尋找有效的靶向分子，對結(jié)直腸癌患者來說，至關(guān)重要。

圖2 TMSG-1、Ki-67、Pgp1之間相關(guān)性比較

TMSG-1屬于一種跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體以及細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)定位存在。TMSG-1表達(dá)高低與腫瘤轉(zhuǎn)移有聯(lián)系，在體外實(shí)驗(yàn)研究中顯示，TMSG-1對肝細(xì)胞癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有抑制效果[10,11]。TMSG-1可以作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在腫瘤患者的診斷和預(yù)后過程中，發(fā)揮著重要作用[12]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中TMSG-1陽性表達(dá)水平較高，說明TMSG-1在結(jié)直腸癌患者組織中顯示高表達(dá)，可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的參與作用。林琳[13]研究指出，TMSG-1在癌旁正常組織中陽性表達(dá)率為100%，在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率較低，本研究結(jié)果與其保持一致。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者組織中Ki-67陽性表達(dá)升高，說明結(jié)直腸癌患者發(fā)病，體內(nèi)Ki-67表達(dá)升高。邵好青等[14]在研究指出指出，Ki-67在結(jié)直腸癌患者組織中陽性表達(dá)率為85%，陽性表達(dá)率較高，與本文研究結(jié)果一致。相關(guān)研究指出，腫瘤耐藥以及患者預(yù)后與P-gP表達(dá)具有相關(guān)性[15]。晚期癌癥患者P-gP陽性表達(dá)較高，患者總生存率顯著降低[16]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者組織中Pgp1陽性表達(dá)上升。說明Pgp1在結(jié)直腸癌患者組織中顯示高表達(dá)，參與了結(jié)直腸癌的發(fā)病和發(fā)展。本研究結(jié)果與唐孝良等[17]研究結(jié)果保持一致。

本研究結(jié)果指出，結(jié)直腸癌低分化TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)較高。說明TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度有關(guān)。相關(guān)研究指出，結(jié)直腸癌患者組織中Ki-67陽性表達(dá)較高，患者結(jié)直腸癌分化程度降低，Ki-67陽性表達(dá)增加，說明Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌增殖有關(guān)[18]。有研究指出，如果腫瘤將黏膜肌層穿透后到達(dá)黏膜下層時(shí)，腫瘤會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者病情會(huì)加重，轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤[19]。本研究指出，結(jié)直腸癌漿膜下浸潤TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)高，說明TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤深度有關(guān)。本結(jié)果中，結(jié)直腸癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)較高，說明TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)與結(jié)直腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過本文研究得出結(jié)論，TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)與結(jié)直腸癌病理分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。鐘華等[20]研究指出，結(jié)直腸癌浸潤深度增加以及淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌組織Ki-67陽性表達(dá)上升，提示Ki-67表達(dá)高低于結(jié)腸癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本文研究結(jié)果與其保持一致。

本文通過對TMSG-1、Ki-67、Pgp1進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，TMSG-1與Ki-67之間呈負(fù)相關(guān)，TMSG-1與Pgp1之間呈負(fù)相關(guān)，Ki-67與Pgp1之間呈正相關(guān)。說明TMSG-1、Ki-67、Pgp1在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用，為結(jié)直腸癌治療尋找有效的靶向基因，提供理論參考。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者TMSG-1、Ki-67、Pgp1表達(dá)與患者的病理分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，TMSG-1、Ki-67、Pgp1之間具有相關(guān)性，隨結(jié)直腸癌患者病情發(fā)展，出現(xiàn)異常表達(dá)，為結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療提供一定的理論參考。