吳貴福 董春萍 高珊 李輝

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病初期的微血管并發(fā)癥，已成為主要的致盲性疾病之一。DR的發(fā)病機制尚不十分明確，一般認為高血糖是引起糖尿病患者視網(wǎng)膜損傷的重要因素[1]，細胞凋亡和氧化應(yīng)激貫穿DR發(fā)病的過程。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國糖尿病患者居全球首位，DR發(fā)病呈增長趨勢，嚴重影響患者視力健康[2]。DR治療方法或手段較多，西藥治療存在一定的局限性，不能從根本上治愈DR。由于中草藥具有低毒、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，中醫(yī)療療法在DR的治療中得到廣泛應(yīng)用[3]。薯蕷皂苷是中藥穿山龍的有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用，其對糖尿病周圍神經(jīng)病變的防治作用也日益受到關(guān)注[4]。研究表明，薯蕷皂苷可增強糖尿病合并頸動脈粥樣硬化患者血清SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，清除血液及組織中的氧自由基及MDA，防止血管內(nèi)皮的氧化損傷[5]。薯蕷皂苷可提高氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞eNOS表達，促進NO的合成與釋放，從而降低血管內(nèi)皮細胞的凋亡[6]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，miR-146a在糖尿病周圍神經(jīng)病變患者外周血中的含量降低，且miR-146a低表達與患者的病情嚴重程度密切相關(guān)[7]。miR-146a在DR患者血清中表達降低，NF-κB和VEGF明顯增加，miR-146a可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和血管增生參與DR的發(fā)病過程[8]。目前，薯蕷皂苷和miR-146a對高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(RRVEC)損傷的影響，以及薯蕷皂苷是否通過調(diào)控miR-146a影響大鼠RRVEC損傷還未見報道。本研究主要探討了薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷的影響及作用機制，以期為DR的治療提供新的作用靶點和新型藥物的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 清潔級SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXR(京)2015-005。薯蕷皂苷粉由國家天然藥物研究中心提供，純度為98%；胎牛血清(FBS)和L-DMEM培養(yǎng)基美國Gibico公司；熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自Invitrogen公司；引物序列由寶生物工程(大連)有限公司 提供；BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天公司；Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3以及內(nèi)參GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；ROS、SOD和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；LipofectamineTM2000試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RRVEC細胞培養(yǎng)和鑒定:參照文獻方法分離培養(yǎng)RRVEC細胞[9]。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，脫頸椎處死，頭部常規(guī)消毒，取出完整眼球。75%酒精消毒30 s，加入預(yù)冷的含200 U/ml青霉素和鏈霉素的PBS沖洗，去除血污。然后置于含預(yù)冷的PBS紗布的培養(yǎng)皿中，獲取視網(wǎng)膜組織，剪碎，加入培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。視網(wǎng)膜組織加入0.1% Ⅰ型膠原酶溶液37℃消化0.5 h，網(wǎng)孔為100 μm的兩層不銹鋼細胞濾網(wǎng)過濾。收集洗脫液，室溫離心(1 500 r/min、5 min)。棄上清液，沉淀加入含肝素鈉和胎牛血清的改良培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第4代RRVEC細胞，以1×104個/ml接種于涂有明膠的蓋玻片上，培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后，取出蓋玻片，免疫細胞熒光染色法鑒定RRVEC細胞。以PBS代替一抗作為陰性對照組，加入Cy3二抗工作液，37℃孵育顯色，熒光顯微鏡觀察。陽性表達時Cy3發(fā)出紅色熒光。

1.2.2 RRVEC細胞分組:對數(shù)生長期的RRVEC細胞，以1×105個/ml濃度接種于6孔板中，每孔1 ml，貼壁后分組處理。實驗設(shè)置5個組，對照組：含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；高糖組：含25 mmol/L葡萄糖、10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；高糖+薯蕷皂苷-低組：含25 mmol/L葡萄糖、4.8μg/ml薯蕷皂苷[6]、10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h；高糖+薯蕷皂苷-中組：含25 mmol/L葡萄糖、12 μg/ml薯蕷皂苷、10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h；高糖+薯蕷皂苷-高組：含25 mmol/L葡萄糖、30 μg/ml 薯蕷皂苷、10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染:對數(shù)生長期的RRVEC細胞，以1×105/ml濃度接種于6孔板中，每孔1 ml。待細胞融合至60%時，利用LipofectamineTM2000參照其說明進行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-miR-146a，細胞分為miR-NC組和miR-146a組。培養(yǎng)6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡:取分組處理后的細胞，PBS清洗后重懸并計數(shù)。取5×104～1×105個重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸，再加入5 μl Annexin V-FITC，混合均勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清。再加入190 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸，10 μl碘化丙啶染色液，4℃避光孵育60 min后上機檢測，Expo32軟件分析，計算細胞凋亡率。

1.2.5 Western Blot法檢測蛋白表達:取分組處理后的細胞，加入蛋白裂解液置于冰上充分裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min。收集上清液，BCA法測定蛋白含量。取適量蛋白質(zhì)，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDS-電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST洗膜后，加入一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ECL顯影液。曝光拍照，BandScan分析條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6 細胞ROS、SOD和MDA水平檢測:取分組處理后的細胞，參照文獻方法[9]，采用流式細胞儀檢測細胞中ROS相對含量。酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞中SOD活力和MDA含量，操作過程嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.2.7 qRT-PCR檢測miR-146a表達:取分組處理后的細胞，Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。miR-146a上游引物序列5’-TGAGAACTGAATTCCATGGGTTA-3’，下游引物序列 5’-TGAGAACTGAATTCCATAGGCTA-3’；U6上游引物序列，5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。擴增條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-146a的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡的影響 流式細胞儀檢測薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞凋亡的影響，高糖組RRVEC細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與高糖組比，薯蕷皂苷干預(yù)后，RRVEC細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，并且不同濃度薯蕷皂苷組間比較差異顯著(P<0.05)。Western Blot進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3表達，結(jié)果顯示，與對照組比，高糖組Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與高糖組比，薯蕷皂苷干預(yù)后，RRVEC細胞Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，且不同濃度薯蕷皂苷組間比較差異顯著(P<0.05)，說明薯蕷皂苷干預(yù)能促進高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞Bcl-2蛋白表達，抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達。見圖1、2，表1。

圖1 凋亡相關(guān)蛋白表達

圖2 薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡的影響，細胞凋亡流式圖

表1 薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-低組組比較，△P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-中組比較，☆P<0.05

2.2 薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC中ROS水平、SOD活性、MDA含量的影響 流式細胞儀檢測RRVEC細胞中ROS相對含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測SOD活性以及MDA含量，高糖組RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯高于對照組(P<0.05)，SOD活性明顯低于對照組(P<0.05)，而薯蕷皂苷干預(yù)后，RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯低于高糖組(P<0.05)，SOD活性明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

組別ROS水平(%)SOD活性(U/mg)MDA含量(nmol/mg)對照組100.00±0.00156.87±9.683.67±0.31高糖組198.74±13.52?78.64±8.03?9.81±0.72?高糖+薯蕷皂苷-低組177.29±11.43#95.38±9.14#8.12±0.64#高糖+薯蕷皂苷-中組159.37±10.26#△114.39±9.96#△6.88±0.47#△高糖+薯蕷皂苷-高組134.34±9.74#△☆131.67±8.63#△☆4.85±0.42#△☆ F值214.507168.704320.791 P值0.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-低組組比較，△P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-中組比較，☆P<0.05

2.3 薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC中miR-146a表達的影響 采用qRT-PCR檢測RRVEC細胞中miR-146a表達，高糖組miR-146a表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。與高糖組比，薯蕷皂苷干預(yù)后，RRVEC細胞miR-146a表達明顯升高(P<0.05)，且呈濃度依賴性。見表3。

組別miR-146a對照組1.04±0.08高糖組0.18±0.03?高糖+薯蕷皂苷-低組0.37±0.04#高糖+薯蕷皂苷-中組0.59±0.05#△高糖+薯蕷皂苷-高組0.81±0.08#△☆ F值492.008 P值0.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-低組組比較，△P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-中組比較，☆P<0.05

2.4 miR-146a過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC損傷的影響 分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-146a至高糖誘導(dǎo)后RRVEC細胞，qRT-PCR法檢測miR-146a水平驗證轉(zhuǎn)染效率，高糖+miR-146a組RRVEC細胞中miR-146a水平明顯高于高糖+miR-NC組(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，高糖+miR-146a組RRVEC細胞凋亡率明顯低于高糖+miR-NC組(P<0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與高糖+miR-NC組比，高糖+miR-146a組RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測RRVEC細胞中ROS相對含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測MDA含量和SOD活性，結(jié)果顯示，與高糖+miR-NC組比，高糖+miR-146a組RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯提高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 凋亡相關(guān)蛋白表達

表4 miR-146a過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC損傷的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖+miR-NC組比較，#P<0.05

2.5 抑制miR-146a表達逆轉(zhuǎn)了薯蕷皂苷(30 μg/ml)對高糖誘導(dǎo)的RRVEC損傷的影響 分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-146a至高糖誘導(dǎo)后RRVEC細胞，再使用30μg/ml的薯蕷皂苷干預(yù)轉(zhuǎn)染后的高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞，qRT-PCR檢測miR-146a水平，結(jié)果顯示，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞中miR-146a水平明顯低于高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞凋亡率明顯高于高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組(P<0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測RRVEC細胞中ROS相對含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測MDA含量和SOD活性，結(jié)果顯示，與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達

3 討論

細胞凋亡在DR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。糖尿病視網(wǎng)膜損傷最早發(fā)生在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(RRVEC)，高血糖代謝紊亂可導(dǎo)致RRVEC細胞凋亡，進而造成無細胞毛細血管結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，以及毛細血管基底膜增厚、微動脈瘤形成等組織病理的改變[10-12]。降低高血糖引起的RRVEC細胞凋亡可能減輕DR，有利于疾病治療。本研究流式細胞儀檢測結(jié)果表明，高糖誘導(dǎo)RRVEC細胞后，細胞凋亡率明顯升高，與相關(guān)報道結(jié)果一致，說明高糖能夠促進RRVEC細胞凋亡。薯蕷皂苷干預(yù)高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞，細胞凋亡率明顯降低，且薯蕷皂苷越高，凋亡率越低，說明薯蕷皂苷可劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，兩者均在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[13]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3是多種凋亡程序啟動的執(zhí)行者，其通過激活核內(nèi)核酸酶裂解DNA片段，進而觸發(fā)凋亡，參與細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。Western Blot檢測結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)后，RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平降低，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高，而薯蕷皂苷干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平升高，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低，提示薯蕷皂苷可能通過促進RRVEC細胞Bcl-2蛋白表達，抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞凋亡。

注：與高糖組比較，*P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比較，#P<0.05

氧化應(yīng)激在DR的發(fā)病過程中也起關(guān)鍵作用，其可通過多種機制造成RRVEC損傷[15]。拮抗氧化應(yīng)激引起的RRVEC損傷是早起治療DR的新手段。大量活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生是氧化應(yīng)激損傷的機制[16]。ROS可通過改變細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性影響細胞功能[17]。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量高低可間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度[18]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，其活性高低可反映機體清除ROS的能力[19]。同時，ROS的大量產(chǎn)生也會引起SOD活性的降低。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)后，RRVEC細胞ROS水平和MDA含量升高，SOD活性降低，說明高糖誘導(dǎo)能夠引起RRVEC細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷細胞。薯蕷皂苷干預(yù)高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞，細胞內(nèi)ROS水平和MDA含量降低，SOD活性升高，并且呈濃度依賴性，提示薯蕷皂苷可能通過降低高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞氧化應(yīng)激減輕對細胞的損傷。

miR-146a是miR-146家族成員之一，被普遍認為是一個與年齡有關(guān)、涉及血管重構(gòu)過程的標志物[20]。研究表明，miR-146a與DR的關(guān)系十分密切。郝義等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中表達水平降低，miR-146a過表達可抑制VEGF-A mRNA和蛋白表達水平，可能成為視網(wǎng)膜色素上皮細胞衰老的新型分子標記物。本研究qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞中miR-146a表達水平明顯降低，說明高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞中miR-146a呈低表達，miR-146a可能是治療DR的新靶點，提示促進RRVEC細胞中miR-146a表達可能有助于該疾病的治療。通過轉(zhuǎn)染miR-146a至高糖誘導(dǎo)后RRVEC細胞，構(gòu)建miR-146a過表達的高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，miR-146a過表達可抑制高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞凋亡。Western Blot檢測結(jié)果顯示，miR-146a過表達可促進高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞Bcl-2蛋白表達，抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達。此外，miR-146a過表達還能夠降低高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量，提高SOD活性，說明miR-146a過表達可保護高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞氧化損傷。為了進一步明確薯蕷皂苷是否通過調(diào)控miR-146a表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞損傷發(fā)揮保護作用，qRT-PCR檢測檢測了薯蕷皂苷干預(yù)后高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞中miR-146a水平，結(jié)果顯示，薯蕷皂苷干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞miR-146a表達明顯升高，提示薯蕷皂苷可能促進高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞miR-146a表達。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-146a至高糖誘導(dǎo)后RRVEC細胞，再用30 μg/ml的薯蕷皂苷干預(yù)轉(zhuǎn)染后高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞，結(jié)果顯示，與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞凋亡率、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及ROS水平和MDA含量明顯升高，Bcl-2蛋白水平和SOD活性明顯降低，說明miR-146a過表達逆轉(zhuǎn)了薯蕷皂苷對高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，提示薯蕷皂苷通過調(diào)控miR-146a表達影響高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞損傷。

綜上所述，薯蕷皂苷可有效降低高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞凋亡和氧化應(yīng)激，保護高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞損傷。高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞中miR-146a呈低表達，薯蕷皂苷可能通過促進RRVEC細胞miR-146a表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC細胞發(fā)揮保護作用。