汪全超，陳帥飛

華南地區(qū)8種桉樹基因型對的抗病性研究

汪全超，陳帥飛＊

(國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

由麗赤殼屬真菌引起的桉樹葉焦枯病是我國桉樹最具威脅的病害之一。本研究利用孢子懸浮液噴霧接種法將兩株菌株接種至華南地區(qū)廣泛種植的8種桉樹基因型，包括7種尾巨桉基因型CEPT1848、CEPT1849、CEPT1850、CEPT1851、CEPT1852、CEPT1853和CEPT1855，以及1種尾赤桉基因型CEPT1854。通過比較焦枯葉片百分比評估各桉樹基因型的抗病性。結(jié)果表明7種尾巨桉基因型的抗病性存在顯著差異，基因型CEPT1851的抗病性最強，基因型CEPT1849、CEPT1850和CEPT1855的抗病性相對弱；尾赤桉基因型CEPT1854的抗病性介于7個尾巨桉基因型之間。方差分析表明，菌株和桉樹基因型之間存在交互效應(yīng)。本研究結(jié)果擬為桉樹抗病選育過程中病原菌菌株和桉樹基因型的選擇提供一定的指導(dǎo)。

桉樹葉焦枯?。恢虏×?；抗病性；病害防控

由麗赤殼屬()真菌引起的人工林桉樹葉焦枯病和苗圃桉樹苗莖腐病對我國桉樹的健康生長帶來一定危害[1-5]。1985年，由麗赤殼屬真菌引起的桉樹苗病害在海南被發(fā)現(xiàn)[6]；1991年，由麗赤殼屬真菌導(dǎo)致的桉樹葉焦枯病在廣西被報道[7]；隨后，桉樹葉焦枯病在福建、廣東和云南等地相繼被報道[8-10]。前期研究表明，桉樹葉焦枯病廣泛分布于我國福建、廣東、廣西、海南和云南等地，是危害我國桉樹人工林最嚴(yán)重的病害之一[2-3]。

不同桉樹基因型對麗赤殼屬病原菌的抗病性存在顯著差異，選育抗病桉樹基因型是防控桉樹葉焦枯病的有效途徑之一[3,8,11-14]。前期研究結(jié)果表明，是引起雷州半島地區(qū)桉樹葉焦枯病的病原菌優(yōu)勢物種[3]。本研究通過測試華南地區(qū)廣泛種植的8種桉樹基因型對的抗病性，評估了不同桉樹基因型的抗病性差異，以期為桉樹抗病選育過程中病原菌菌株和桉樹基因型的選擇提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌菌株

2017－2018年，對廣東省南部雷州半島地區(qū)的14個樣點進(jìn)行系統(tǒng)的病害調(diào)查和樣品采集，包括13個桉樹人工林及1個桉樹苗圃。對采集的樣品進(jìn)行分離，并利用多基因序列系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，病原菌一致被鑒定為。選擇兩株菌株CSF13317和CSF13636作為供試菌株。

1.2 供試桉樹材料

選擇華南地區(qū)廣泛種植的8種不同桉樹基因型的組培苗進(jìn)行抗病性測試，包括7種尾巨桉(×)基因型CEPT1848、CEPT1849、CEPT1850、CEPT1851、CEPT1852、CEPT1853和CEPT1855，以及1個尾赤桉(×)基因型CEPT1854。組培苗于2019年7－10月在蔭棚中培育，長至3個月約40 cm高時，進(jìn)行接種試驗。

1.3 培養(yǎng)基的配制

2% MEA固體培養(yǎng)基的配制：分別稱取20 g瓊脂粉和20 g麥芽粉，倒入大于1 L的防爆瓶，加入1 L蒸餾水，搖晃混勻后，放入高溫高壓滅菌鍋在121°C滅菌20 min，再分裝至已滅菌的培養(yǎng)皿中。

1.4 病原菌分生孢子懸浮液的配制

在25°C下將菌株在2% MEA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，待平板上長出孢子后，使用無菌針挑取直徑1 cm、帶有孢子的菌餅在新的MEA培養(yǎng)基表面均勻涂布。于25℃下繼續(xù)培養(yǎng)5 ~ 6 d，待培養(yǎng)基表面產(chǎn)生大量無性孢子后，加入適量無菌水，用無菌軟刷輕刷培養(yǎng)基表面，收集孢子懸浮液；將搜集的孢子懸浮液原液倒入已滅菌的燒杯中，利用血球計數(shù)板對孢子懸浮液原液濃度進(jìn)行測量，并用無菌水稀釋調(diào)節(jié)濃度至1 × 104個·mL-1。測量8次，取平均值。

1.5 致病力測試

本研究采用孢子懸浮液噴霧接種法進(jìn)行致病力測試。接種前24 h將桉樹苗放入塑料小溫室中，使溫室內(nèi)溫度和濕度分別保持在26 ~ 28℃和70% ~ 80%。接種時將孢子懸浮液噴灑至桉樹苗葉片正面和背面，使葉面達(dá)到沾滿水珠狀態(tài)，每株菌株分別接種至每個桉樹基因型的8株苗。每個桉樹基因型的8株苗噴灑無菌水，作為對照。接種72 h后進(jìn)行致病力統(tǒng)計。整個試驗在相同條件下重復(fù)一次。

接種72 h后，打開塑料溫室，統(tǒng)計每株接種桉樹苗總?cè)~片數(shù)和焦枯葉片數(shù)，通過計算每株桉樹苗焦枯葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的百分比來評價接種菌株的致病力大小和各桉樹基因型的抗病性差異。

1.6 病原菌接種后再分離

為驗證病害癥狀是否由接種的菌株引起，采用組織分離法對接種桉樹苗的葉片進(jìn)行病原菌再分離。用已滅菌的手術(shù)刀切取感病葉片病健交界處，大小約0.04 cm2，將其放至2% MEA固體培養(yǎng)基中，室溫下培養(yǎng)4 ~ 5 d后，觀察有無菌落產(chǎn)生，并根據(jù)菌落形態(tài)和產(chǎn)生分生孢子的形態(tài)來確定產(chǎn)生的菌落是否由接種的菌株產(chǎn)生。每株菌株接種的每種桉樹基因型再分離4張葉片。對噴灑無菌水的桉樹苗，觀察葉片上是否有病斑產(chǎn)生，并用無菌手術(shù)刀切取葉片，大小約0.04 cm2，轉(zhuǎn)接至2% MEA固體培養(yǎng)基，根據(jù)菌落產(chǎn)生的有無和形態(tài)，判斷噴灑無菌水與接種菌株桉樹葉片的差異。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對焦枯葉片百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換，得正態(tài)分布數(shù)據(jù)后，采用EXCEL整理原始試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 22軟件(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)進(jìn)行方差分析。具體分析包括：(1) 針對試驗、菌株和桉樹基因型三個因素，以焦枯葉片面積百分比為變量，對兩次試驗之間的差異進(jìn)行三因素單變量方差分析；(2) 針對菌株和桉樹基因型兩個因素，以焦枯葉片百分比為變量，對兩株菌株在8種桉樹基因型上的致病力差異進(jìn)行雙因素單變量方差分析；(3) 桉樹基因型因素以焦枯葉片百分比為變量，對8個桉樹基因型間的抗病性差異進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病癥狀

接種72 h后，兩株菌株在8種桉樹基因型上均產(chǎn)生病害癥狀，桉樹苗葉片出現(xiàn)大量灰褐色病斑，其周圍呈水漬狀(圖1A，B)，隨后病斑不斷擴大相連，引起葉片焦枯(圖1C)；部分桉樹苗頂梢和莖干腐爛(圖1D–G)，在感病部位表面產(chǎn)生大量的屬真菌分生孢子團(tuán)(圖1D，G)。接種無菌水的桉樹苗上未發(fā)現(xiàn)感病癥狀。接種結(jié)果顯示，兩株菌株在同一桉樹基因型上引起的病害程度具有一定差異(圖2A，B)，同一株在不同桉樹基因型上引起的病害程度也具有一定差異(圖2D–G)。

另外，8種桉樹基因型在接種后產(chǎn)生病害癥狀的部位具有一定差異，除桉樹基因型CEPT1854的感病部位主要為葉片中下部，其余7種桉樹基因型的整株苗的葉片均出現(xiàn)感病癥狀。

圖1 桉樹苗接種Calonectria pentaseptata菌株后產(chǎn)生的典型病害癥狀

注：A–C為桉樹葉片上產(chǎn)生的灰褐色病斑和葉片焦枯癥狀；D–E為桉樹苗頂梢感病后腐爛并產(chǎn)生大量的屬真菌分生孢子團(tuán)；F–G為感病莖干變黑腐爛并產(chǎn)生大量的屬真菌分生孢子團(tuán)。

2.2 病原菌接種后再分離

再分離結(jié)果顯示，在感病桉樹葉片病健交界處分離的菌株與最初接種菌株菌落形態(tài)一致，而在噴灑無菌水的桉樹苗上未分離出麗赤殼屬真菌。

2.3 兩次試驗差異分析

由表1可知，試驗(2次)、菌株(2株)和桉樹基因型(8個)因素內(nèi)差異顯著(均小于0.001)。因素之間的方差分析結(jié)果顯示，菌株×試驗差異不顯著(=0.121)，其余菌株(=5.64 × 10–33)，桉樹基因型(=1.94 × 10–23)，試驗(=2.49 × 10–4)，菌株×桉樹基因型(=3.93 × 10–7)，桉樹基因型×試驗(=3.23 × 10–8)，菌株×桉樹基因型×試驗差異都顯著(=0.012)。由于兩次試驗之間存在顯著性差異，對兩次試驗結(jié)果分別分析。

表1 試驗、菌株和桉樹基因型三因素單變量方差分析結(jié)果

圖2 不同桉樹基因型接種不同Calonectria pentaseptata菌株后產(chǎn)生的病害癥狀對比

注：A–C為桉樹基因型CEPT1849接種菌株CSF13317孢子懸浮液（A）、菌株CSF13636孢子懸浮液（B）和噴灑無菌水（C）后的癥狀；D–G為桉樹基因型CEPT1849（D）、CEPT1850（E）、CEPT1851（F）和CEPT1854（G）接種菌株CSF13317孢子懸浮液后癥狀。

2.4 菌株在桉樹基因型上致病力差異分析

由圖3可知，菌株CSF13317在8個桉樹基因型上的致病力均大于菌株CSF13636；其中菌株CSF13317對桉樹基因型CEPT1848、CEPT1849、CEPT1850、CEPT1854和CEPT1855的致病力顯著大于菌株CSF13636(0.001)；菌株CSF13317和CSF13636在桉樹基因型CEPT1851、CEPT1852和CEPT1853上的致病力差異不顯著(=0.05 ~ 0.3)。菌株與桉樹基因型之間存在交互效應(yīng)(=2.27 × 10–6)，例如菌株CSF13317和CSF13636對桉樹基因型CEPT1851的致病力差異不顯著(=0.272)，菌株CSF13317對桉樹基因型CEPT1848的致病力顯著大于菌株CSF13636(<0.001)。

圖3 第1次試驗兩株Calonectria pentaseptata(CSF13317和CSF13636)對8個桉樹基因型的致病力差異結(jié)果柱狀圖

注：所有數(shù)據(jù)都已進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換，“Control”的結(jié)果為0，豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤，柱狀圖頂部不同字母代表不同處理間差異顯著(=0.05)，下同。

由圖4可知，菌株CSF13317對8個桉樹基因型的致病力均強于CSF13636；其中菌株CSF13317對桉樹基因型CEPT1849、CEPT1850、CEPT1852、CEPT1853和CEPT1855的致病力顯著大于菌株CSF13636(0.001 ~ 0.025)；兩株菌對CEPT1848、CEPT1851和CEPT1854的致病力差異不顯著(=0.05 ~ 0.45)。菌株與桉樹基因型之間存在交互效應(yīng)(=0.006)，例如菌株CSF13317和CSF13636對桉樹基因型CEPT1851的致病力差異不顯著(=0.056)，菌株CSF13317對桉樹基因型CEPT1849的致病力顯著大于菌株CSF13636(<0.001)。

兩次試驗結(jié)果表明，菌株CSF13317對8個桉樹基因型的致病力均強于CSF13636；且菌株CSF13317對桉樹基因型CEPT1849、CEPT1850和CEPT1855的致病力顯著強于菌株CSF13636，兩株菌對CEPT1851的致病力差異不顯著。

2.5 桉樹基因型抗病性差異分析

圖5的結(jié)果顯示，桉樹基因型CEPT1851抗病性最強，顯著強于除CEPT1852的其他桉樹基因型(<0.05)；CEPT1852、CEPT1853和CEPT1854的抗病性較強，顯著強于除CEPT1851的其他桉樹基因型(<0.05)；CEPT1855的抗病性最弱，顯著弱于除CEPT1848的其他6個桉樹基因型(<0.05)。8個桉樹基因型的抗病性從強到弱的順序為CEPT1851>CEPT1852>CEPT1854>CEPT1853>CEPT1850>CEPT1849>CEPT1848>CEPT1855。

由圖6可知，桉樹基因型CEPT1851的抗病性最強(<0.05)，顯著強于除CEPT1853和CEPT1854的其他5個桉樹基因型；CEPT1853和CEPT1854的抗病性較強，顯著強于CEPT1850(<0.05)；CEPT1850的抗病性最弱，顯著弱于CEPT1851、CEPT1853和CEPT1854(<0.05)。8個桉樹基因型的抗病性強弱順序為CEPT1851>CEPT1853>CEPT1854>CEPT1848>CEPT1852>CEPT1849>CEPT1855>CEPT1850。

兩次試驗結(jié)果一致顯示，桉樹基因型CEPT1851的抗病性最強；其次是CEPT1852、CEPT1853和CEPT1854；CEPT1849、CEPT1850和CEPT1855的抗病性較弱。

圖4 第2次試驗兩株Calonectria pentaseptata（CSF13317和CSF13636）對8個桉樹基因型的致病力差異結(jié)果柱狀圖

圖5 第1次試驗8個桉樹基因型對兩株Calonectria pentaseptata抗病性差異結(jié)果柱狀圖

圖6 第2次試驗8個桉樹基因型對兩株Calonectria pentaseptata抗病性差異結(jié)果柱狀圖

3 結(jié)論與討論

本研究通過將兩株菌株接種至8種華南地區(qū)廣泛種植的桉樹基因型上進(jìn)行致病力試驗，結(jié)果顯示接種3 d后，供測桉樹基因型上出現(xiàn)葉片焦枯、莖干腐爛等癥狀，該結(jié)果與野外觀察到的桉樹葉焦枯病感病癥狀相似。致病力測試結(jié)果表明病原菌不同菌株對同一桉樹基因型的致病力差異顯著，不同桉樹基因型對菌株的抗病性存在顯著差異。

方差分析結(jié)果顯示兩次試驗存在顯著差異，這可能與兩次試驗的時間不同有關(guān)，導(dǎo)致試驗過程的溫度、濕度并不完全一致，且兩次試驗桉樹苗的生長狀況也存在差異。方差分析結(jié)果顯示菌株×桉樹基因型差異顯著，表明病原菌菌株與桉樹基因型在致病性/抗病性上存在交互效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，的致病力存在較大的種內(nèi)差異。測試的兩株菌株在部分桉樹基因型上的致病力差異顯著，這與FREITAS等[15]的研究結(jié)果相似，F(xiàn)REITAS等用7株菌株接種至同一種巨尾桉(×)基因型，結(jié)果顯示不同菌株間的致病力存在顯著差異。

本研究采用孢子懸浮液接種法進(jìn)行病原菌致病力測試和桉樹抗病性測試。目前，麗赤殼屬真菌的致病力接種方法主要是通過噴灑孢子懸浮液進(jìn)行接種，此方法產(chǎn)生病害的癥狀與野外桉樹感病的癥狀相似[3,13,15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，許多菌株在多種誘導(dǎo)產(chǎn)孢的條件下均未能產(chǎn)生大量孢子[17]。此外，孢子懸浮液接種后對病害程度進(jìn)行統(tǒng)計評估也比較復(fù)雜，菌餅接種法是一種高效的接種方法[18-19]，但孢子懸浮液接種法和菌餅接種法的關(guān)聯(lián)研究尚未見報道，后續(xù)需要針對兩種接種方法結(jié)果是否存在關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。

首次在越南的桉樹和澳洲堅果上被發(fā)現(xiàn)[20]。隨后，在中國的廣東、廣西和海南等地的桉樹人工林感病植株以及林下土壤中被發(fā)現(xiàn)[8,21]。2017－2018年，WANG等[3]對雷州半島地區(qū)的桉樹人工林和桉樹苗圃進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)桉樹葉焦枯病在雷州半島多種桉樹基因型上大范圍暴發(fā)，其病原菌被鑒定為。

由麗赤殼屬真菌引起的桉樹葉焦枯病給我國桉樹帶來持續(xù)不斷的危害[2-3,8,22-23]，而選育抗病桉樹基因型是防控桉樹葉焦枯病的重要途徑之一[8,11-13]。本研究結(jié)果為篩選抗病桉樹基因型實踐過程中病原菌菌株的選擇、桉樹基因型的選擇以及試驗設(shè)計提供借鑒和指導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，不同桉樹基因型之間的抗病性存在顯著差異。本研究使用的8種供測桉樹基因型，其中7種屬于尾巨桉，1種屬于尾赤桉，致病力結(jié)果表明7個尾巨桉不同基因型之間的抗病性存在顯著差異，尾赤桉基因型的抗病性介于7個尾巨桉基因型之間。國內(nèi)外的其他研究結(jié)果均表明桉樹不同基因型之間的抗病性存在差異[12-14]。CHEN等[14]利用從福建分離到的4種麗赤殼屬真菌對G9和DH32-29兩種桉樹基因型進(jìn)行致病力測試，結(jié)果表明兩種桉樹基因型對麗赤殼屬真菌的抗病性存在顯著差異。RODAS等[12]對巨桉()的42個基因型的進(jìn)行抗病性試驗發(fā)現(xiàn)，不同巨桉基因型間的抗病性存在顯著差異。2016年，ALFENAS等[13]將接種至17個桉樹樹種，發(fā)現(xiàn)不同桉樹樹種之間的抗病性存在很大的種內(nèi)及種間差異。因此，選擇抗病桉樹基因型是實現(xiàn)桉樹葉焦枯病防控的有效途徑，未來需要進(jìn)一步加強此類研究。

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The Resistances of EightGenotypes in Southern China to

WANG Quanchao, CHEN Shuaifei

(,,,)

leaf blight caused byis considered as one of the most important diseases of plantationspecies in China. In this paper, the resistances of eight widely plantedclonal genotypes towas tested by spraying the conidial suspension on to leaves of these genotypes. The eight genotypes include seven×genotypes (CEPT1848, CEPT1849, CEPT1850, CEPT1851, CEPT1852, CEPT1853, CEPT1854) and one×genotype (CEPT1855). The resistance of eachgenotype was evaluated by comparing the percentage of rotten/blighted leaves. The results showed that there were significant differences in the resistances among the seven genotypes of×. The genotype CEPT1851 was most tolerant while CEPT1849, CEPT1850 and CEPT1855 were less tolerant than others. In addition, the resistance of×genotype CEPT1855 was moderate. Analysis of variance (ANOVA) showed that theisolate ×genotype interaction exists. The results of this study provide guidance for the selection of pathogen strains andgenotypes to assist the process of breedingfor disease resistance.

leaf blight; pathogenicity; resistance; disease prevention and control

S763.15

A

10.13987/j.cnki.askj.2020.02.01

國家重點研發(fā)計劃課題“桉樹高效可持續(xù)經(jīng)營技術(shù)”(2016YFD0600505)

汪全超(1994－ )，男，在讀碩士研究生，主要從事森林病害研究，E-mail: wangquanchaocerc@163.com

陳帥飛(1982－ )，男，博士，研究員，主要從事森林病害研究，E-mail:cerccsf@126.com