王留洋， 梅向東, 張 智, 翁愛(ài)珍, 馬好運(yùn),折冬梅, 寧 君*, 謝愛(ài)婷, 穆常青

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 北京市植物保護(hù)站，北京 100029)

銀錠夜蛾(Macdunnoughiacrassisignawarren)隸屬于鱗翅目夜蛾科，是豆類(lèi)作物和十字花科蔬菜重要的食葉性害蟲(chóng)[1]。幼蟲(chóng)春夏季為害棉花、豆類(lèi)等作物葉片，秋季為害十字花科蔬菜葉片[2]。因其具有暴食性，雜食性等特點(diǎn)，大發(fā)生時(shí)能使作物大量減產(chǎn)甚至絕收。2017年，付曉偉等[2]通過(guò)高空探照燈、卵巢解剖以及碳同位素示蹤技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，銀錠夜蛾是一種遠(yuǎn)距離遷飛性害蟲(chóng)，這無(wú)疑增加了銀錠夜蛾的防治難度。銀錠夜蛾在我國(guó)發(fā)生2～4代，在枯枝、淺表層等場(chǎng)所以卵的形式越冬，翌年5月開(kāi)始羽化，6月份進(jìn)入越冬蟲(chóng)態(tài)盛發(fā)期[4]。目前，國(guó)內(nèi)防治銀錠夜蛾主要借助農(nóng)藥[5]，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的不正確使用，不僅會(huì)殺傷天敵，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)農(nóng)藥殘留量過(guò)高、環(huán)境污染及害蟲(chóng)的抗藥性等問(wèn)題。因此，迫切需要綠色、安全、高效的新途徑來(lái)防治銀錠夜蛾。

昆蟲(chóng)性信息素的研究為高效防治害蟲(chóng)開(kāi)辟了新型綠色途徑，但隨著對(duì)昆蟲(chóng)性信息素的研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)釋放快、持效期短[6]、長(zhǎng)期使用單一組分的性信息素可能會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生等缺點(diǎn)[7]。性信息素類(lèi)似物與天然性信息素相比具有更好的物理、化學(xué)和毒理性特性，并可增加特異選擇性[8]。Wright等[9]1965年便提出修改性信息素結(jié)構(gòu)的方式可實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)控制；Beroza等[10]證實(shí)棉紅鈴蟲(chóng)(Pectinophoragossypiella)性信息素中添加少量性信息素類(lèi)似物十四碳烯-1-醇乙酸酯可改變棉紅鈴蟲(chóng)的誘捕量；Roelofs等[11]將紅帶卷夜蛾(Pink bollworm moth)性信息素順-11-十四碳烯乙酸酯中加入氧原子或硫原子，可明顯增強(qiáng)性信息素的誘捕效果；Camps等[12]發(fā)現(xiàn)松異舟蛾(Thaumetopoeapityocampa)性信息素與甲酸酯和丙酸酯的性信息素類(lèi)似物混合后能增加松異舟蛾的誘捕數(shù)量。性信息素類(lèi)似物的合成已成為研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)[13]表明，含鹵素修飾的性信息素類(lèi)似物可增強(qiáng)分子的脂溶性，并能更有效的被昆蟲(chóng)嗅覺(jué)受體識(shí)別；性信息素中以硫原子作為氧原子的電子等排體進(jìn)行取代部分的氧原子后可得到硫代類(lèi)似物[14]，可降低嗅覺(jué)細(xì)胞的反應(yīng)，具有潛在的性信息素識(shí)別的抑制效應(yīng)[15]。本文以銀錠夜蛾性信息素前體順-7-十二碳烯醇(Z7-12:OH)為起始原料，分別與含氟、溴、硫取代的酰氯或酸酐進(jìn)行合成類(lèi)似物(Y1～Y6， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振(NMR)和高分辨質(zhì)譜(HR-MS)表征。并對(duì)類(lèi)似物進(jìn)行觸角電生理試驗(yàn)(EAG)測(cè)試，旨在篩選出活性較高的性信息素類(lèi)似物，為銀錠夜蛾性信息素類(lèi)似物的合成研究提供理論依據(jù)。

Chart 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker DPX-300 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker solariX型觸角電位儀；PRX-450D型智能人工氣候箱。

成蟲(chóng)采集于北京市延慶區(qū)舊縣鎮(zhèn)有機(jī)農(nóng)業(yè)示范園(40°54′51.20″N，116°06′81.62″E)，采用10%的蜂蜜水配對(duì)飼養(yǎng)，定期收集銀錠夜蛾卵[16]。幼蟲(chóng)置于室內(nèi)人工氣候箱內(nèi)[(25±2) ℃，相對(duì)濕度(60±10)%， L/D=16/8]，用大豆葉飼養(yǎng)。羽化成蟲(chóng)分別放到拇指管(直徑25 mm，長(zhǎng)100 mm)內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)，以10%蜂蜜水飼喂待用；其余所用試劑均為分析純。

Scheme 1

1.2 Y1～Y6的合成(以Y1為例)

將Z7-12:OH 0.5 g(2.71 mmol)溶于10 mL干燥二氯甲烷(DCM)中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.02 g(0.20 mmol)和三乙胺(TEA)0.42 g(4.07 mmol)，冰鹽浴冷卻(-20 ℃),緩慢滴加二氟乙酸酐0.71 g(4.07 mmol)的DCM(2 mL)溶液，滴畢，滴加DCM 0.5～1 mL，滴畢，反應(yīng)30 min后撤去冰鹽??；攪拌下于室溫反應(yīng)過(guò)夜(TLC 監(jiān)測(cè))。用去離子水淬滅反應(yīng)，分液，有機(jī)相依次用飽和食鹽水(3×25 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/30]純化得Y10.53 g。

用類(lèi)似的方法合成Y2～Y6。

Y1： 淡黃色油狀液體，收率74%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 5.93(t,J=54.3 Hz, 1H), 5.30～5.39(m, 2H), 4.28(t,J=13.4 Hz, 2H), 2.02(d,J=3.6 Hz, 4H), 1.67～1.74(m, 2H), 1.26～1.40(m, 10H), 0.83～0.97(m, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 170.12, 131.71(C2), 128.64, 66.49, 32.56, 30.62(C3), 26.45(C3), 23.22, 14.11; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H23O2F2Na{[M+Na]+}285.1644, found 285.1637。

Y2： 淡黃色油狀液體，收率60%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 5.36～5.39(m, 2H), 4.34(t,J=13.6 Hz, 4H), 1.98(t,J=6.1 Hz, 4H), 1.75(t,J=24.4 Hz, 2H), 1.31～1.35(m, 10H), 0.89(t,J=12.5 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 171.07, 131.34(C2), 124.61, 66.39, 32.31, 30.18(C3), 26.69(C3), 23.16, 14.32; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H23O2F3Na{[M+Na]+}303.1551, found 303.1572。

Y3： 淡黃色油狀液體，收率62%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 5.35(t,J=9.5 Hz, 2H), 4.37(t,J=16.3 Hz, 2H), 2.02(t,J=3.8 Hz, 4H), 1.75(t,J=18.6 Hz, 4H), 1.33～1.36(m, 10H), 0.91(t,J=10.1 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 164.05, 134.52, 130.61(C2), 119.54, 65.23, 32.12, 29.90(C2), 25.91, 27.42(C2), 25.98, 22.84, 14.21; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H23O2F5Na{[M+Na]+}353.3292, found 353.3261。

Y4： 無(wú)色透明液體，收率18%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 5.32(t,J=18.7 Hz, 2H), 4.71～4.74(m, 1H), 4.06(t,J=7.6 Hz, 2H), 2.13～2.17(m, 4H), 1.96(s, 3H), 1.74～1.85(m, 2H), 1.70～1.75(m, 10H), 0.90(t,J=15.6 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 130.61(C2), 118.20, 70.02, 32.15, 29.73(C2), 28.61, 27.47(C2), 25.79, 22.85, 14.20; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H23O3SF3Na{[M+Na]+}339.3392, found 339.3381。

Y5： 淡黃色油狀液體，收率59%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 5.44～5.49(m, 2H), 4.44(t,J=15.6 Hz, 1H), 4.21～4.24(m, 2H), 2.05(s, 4H), 1.91(t,J=10.5 Hz, 3H), 1.44～1.51(m, 2H), 1.42～1.43(m, 10H), 0.90(t,J=10.5 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 166.71, 130.60(C2), 64.52, 40.19, 32.15, 29.41(C3), 27.42(C2), 25.96, 22.82, 21.40, 14.21; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H27O2BrNa{[M+Na]+}341.1094, found 341.1079。

Y6： 淡黃色油狀液體，收率34%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 5.30(t,J=6.4 Hz, 2H), 4.13(t,J=15.6 Hz, 2H), 2.81～2.84(m, 2H), 2.58(t,J=18.6 Hz, 2H), 2.13～2.17(m, 4H), 2.07(d,J=10.8 Hz, 3H), 1.76～1.82(m, 2H), 1.25～1.37(m, 10H), 0.91(t,J=6.0 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 171.12, 130.61(C2), 65.26, 34.27, 32.12(C2), 29.99(C3), 27.47(C2), 25.91, 22.80, 15.14, 14.23; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H30O2SNa{[M+Na]+}309.4640, found 309.4625。

1.3 EAG活性測(cè)定

將羽化的銀錠夜蛾雄蟲(chóng)放到拇指管中，用10%的蜂蜜水喂養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)前黑暗處理2 h[17]。將處理后的銀錠夜蛾雄蟲(chóng)用鑷子在顯微鏡下摘除完整的觸角，用刀片切除觸角兩端，保證在測(cè)試過(guò)程中電流的暢通。用注滿(mǎn)0.1 M氯化鉀溶液的尖端玻璃吸管電極將觸角連接在電極探頭上。用移液槍吸取配好的溶液10 μL添加到濾紙條(5 cm×1 cm)上，待溶劑揮發(fā)完全后將濾紙條放入巴斯德管中。每個(gè)處理重復(fù)3次。對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0分析軟件，顯著差異性分析利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)(P<0.05)，利用新復(fù)極差法(Duncan法)進(jìn)行多重比較，結(jié)果用Mean±Stand Error表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

將Z7-12:OH與酸酐反應(yīng)時(shí)，添加少量DMAP作催化劑，可使反應(yīng)更加完全。Z7-12:OH與酰氯反應(yīng)時(shí)，文獻(xiàn)中常選用三乙胺或吡啶作縛酸劑，考慮到吡啶沸點(diǎn)較高，較難除去，且TLC檢測(cè)時(shí)，吡啶在硅膠板上容易擴(kuò)散，因此本文選用三乙胺為縛酸劑。酸酐遇水易溶解，故二氯甲烷需要經(jīng)過(guò)除水處理。為保證醇反應(yīng)完全，Z7-12:OH與酸酐或酰氯的最佳摩爾比為1.0/1.5～1.0/2.0。合成過(guò)程中,由于氟原子的電負(fù)性較強(qiáng)且空間位阻較小，故含氟的性信息素類(lèi)似物產(chǎn)率高于含硫、溴的類(lèi)似物，且在反應(yīng)速度上也高于后者。合成Y4的副產(chǎn)物較多，由于目標(biāo)化合物與雜質(zhì)極性相近，需多次純化，導(dǎo)致收率較低。

2.2 表征

以Y1為例,分析了1H NMR譜圖(圖略) 。由圖可知，與氟原子相連的碳原子上的氫原子受到氟原子和羰基拉電子基的影響，特征峰向低場(chǎng)移動(dòng)(δ5.89附近)。與氧原子相連的亞甲基上的氫原子受到羰基吸電子的作用，化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，特征峰位于δ4.28附近。兩個(gè)順式雙鍵上的氫原子受共軛效應(yīng)的影響，特征峰向低場(chǎng)移動(dòng)(δ5.35)，表現(xiàn)為多重峰。受電子傳導(dǎo)效應(yīng)的影響，與雙鍵相連的碳原子上的氫原子及化學(xué)位移也出現(xiàn)偏移，表現(xiàn)為多重峰，因此與雙鍵相連的碳原子上的氫原子特征峰位于δ2.01附近。化合物中的一個(gè)甲基受旁邊兩個(gè)氫原子的作用表現(xiàn)為三重峰，特征峰位于高場(chǎng)(δ0.90附近)。其他碳上的10個(gè)氫原子的特征峰位于高場(chǎng)δ1.31附近，表現(xiàn)為多重峰。

Dose(μg)圖1 類(lèi)似物(Y1)直接刺激的EAG活性劑量反應(yīng)曲線(xiàn)

2.3 EAG活性

在6種類(lèi)似物不同劑量(0.01 μg、 0.1 μg、 1 μg、 10 μg、 100 μg)處理下，雄蟲(chóng)觸角對(duì)化合物EAG響應(yīng)值如表1所示。發(fā)現(xiàn)所有的性信息素類(lèi)似物在EAG中均能表現(xiàn)一定的生物活性，其中類(lèi)似物Y1電生理響應(yīng)值具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖1)。其中，在10 μg劑量條件下EAG相對(duì)響應(yīng)值達(dá)到最大，為(2.07±0.19)mV，在100 μg劑量條件下EAG相對(duì)響應(yīng)值為(2.04±0.12)mV，其它類(lèi)似物的EAG響應(yīng)相對(duì)較弱。Theresa等[17-21]發(fā)現(xiàn)氟化分子對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合能力增強(qiáng)，因此類(lèi)似物Y1可能在一定程度與觸角上嗅覺(jué)受體結(jié)合緊密有關(guān)。

表1 Y1～Y6直接刺激EAG活性*

*不同小寫(xiě)字母表示同一化合物不同劑量處理下在0.05水平上有顯著差異性。

設(shè)計(jì)并合成了6個(gè)新型的銀錠夜蛾性信息素類(lèi)似物。EAG試驗(yàn)結(jié)果表明，類(lèi)似物Y1表現(xiàn)出較好活性，具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本研究合成的性信息素類(lèi)似物對(duì)綠色防控銀錠夜蛾具有積極的意義，但其田間引誘活性有待進(jìn)一步研究。