孫茂永

(武陟縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南武陟 454950)

20世紀(jì)微生物學(xué)對(duì)人類最為重大的貢獻(xiàn)之一是抗生素的產(chǎn)生，它一產(chǎn)生就在臨床上具有了統(tǒng)治地位，在治療細(xì)菌感染所表現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)使其越來(lái)越難以被其他藥物所取代。因其優(yōu)異的療效，在臨床上開(kāi)始大肆不合理的使用抗生素，并且形成了依賴，大量細(xì)菌已經(jīng)開(kāi)始產(chǎn)生耐藥性，且常以多重耐藥為特點(diǎn)[1-3]。耐藥菌株大量出現(xiàn)后，原本在臨床上用抗生素治療的疾病開(kāi)始出現(xiàn)感染和復(fù)發(fā)，并且往往導(dǎo)致治療失敗，甚至使患病群體死亡，最令人們恐懼的是“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生。現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展迅速，畜牧業(yè)中廣泛使用和濫用抗生素，大量產(chǎn)生抗藥性細(xì)菌，增加了治療難度，同時(shí)也增加了死亡率。中草藥在治療病原菌引起的疾病方面所表現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛引起了全世界的關(guān)注。世界各國(guó)的科學(xué)家也對(duì)中草藥進(jìn)行了越來(lái)越廣泛和深入的研究。中藥在中國(guó)已經(jīng)使用了數(shù)千年，它的毒性副作用很小，成本低，安全性高，無(wú)抗生素耐藥性，本研究對(duì)臨床上多種中草藥進(jìn)行篩選和觀察，選出了在臨床抗菌方面具有成效的5種中藥，觀察其對(duì)豬源大腸桿菌的最小抑菌濃度，同時(shí)測(cè)定其逆轉(zhuǎn)耐藥性，以期為以后治療微生物感染類疾病的理論指導(dǎo)提供幫助以及有效成分的分離及中獸藥臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品 金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草共5種中藥均采購(gòu)于洛陽(yáng)同仁堂大藥房?？股厮幟艏埰⑶嗝顾?、紅霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素和舒巴坦5種抗菌藥物均購(gòu)于上海廣銳生物科技有限公司。

1.1.2 菌種 豬源大腸桿菌(k88、k99)都由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。

1.1.3 試劑 蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂粉、燃燒用酒精、氫氧化鈉、鹽酸、蒸餾水、醫(yī)用消毒酒精。

1.1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、無(wú)菌操作臺(tái)、高壓鍋、天平、電爐、平皿、移液器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥藥液的提取 利用傳統(tǒng)水煎法提取金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草5種中草藥藥液，每種中藥的濃度都為1 g/mL，高壓滅菌鍋內(nèi)在121～126 kpa下滅菌30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 常規(guī)制備。

1.2.3 菌液的制備及稀釋 將實(shí)驗(yàn)室保存的豬源大腸桿菌用接種環(huán)在超凈工作臺(tái)上酒精燈外焰半徑5 cm周圍接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，時(shí)刻注意無(wú)菌操作，而后傾斜放置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱上于37 ℃的條件下培養(yǎng)18 h，之后與標(biāo)準(zhǔn)的麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)照，用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋菌液，稀釋至與0.5號(hào)單位的比濁管濁度相當(dāng)，將其配成大約1.5×108CFU/mL含菌量的實(shí)驗(yàn)用菌液。

1.2.4 中藥抗菌活性的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)利用平皿打孔法來(lái)觀察金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草的抗菌活性，測(cè)定的抑菌圈直徑大小作為衡量抗菌活性大小的依據(jù)，觀察記錄所有三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，計(jì)算其平均值。

1.2.5 中藥最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用梯度稀釋法測(cè)定金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草的最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算其單因素方差，結(jié)果以X+SD表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

所選中藥對(duì)豬源大腸桿菌體外抗菌活性的測(cè)定結(jié)果。中藥對(duì)豬源大腸桿菌體外抗菌活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1和表1、表2、表3。

圖1 中藥對(duì)豬源大腸桿菌體外抗菌活性的測(cè)定結(jié)果Fig 1 Results of antibacterial activity of traditional Chinese medicines to Escherichia coli from pigs

由表1可知金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草這五種中藥的抑菌圈大小，平均抑菌圈直徑(mm)分別為23.6、20.2、22.1、15.3、17.1；由表2和表3可知金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草這五種中藥的MIC(g/mL)分別為0.2、0.3、0.2、0.6、0.5。這說(shuō)明金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚(yú)腥草對(duì)豬源大腸桿菌都有抑菌濃度，抗菌活性最好的為金銀花，五味子，且金銀花和黃連抗菌活性相同，而魚(yú)腥草和赤芍抗菌效果不明顯。

表1 5種中草藥對(duì)豬源大腸桿菌的抑菌圈直徑(mm)Tab 1 diameter of bacteriostatic ring of 5 Chinese herbal medicines against Escherichia coli from pigs (mm)

紙片自身的直徑為7 mm

表2 5味中草藥對(duì)豬源大腸桿菌最小抑菌濃度的測(cè)定Tab 2 determination of minimum inhibitory concentration of 5 Chinese herbal medicines on Escherichia coli from pigs

“++”表示中度長(zhǎng)菌，“+”表示輕度長(zhǎng)菌，“-”表示不長(zhǎng)菌

表3 5種中藥對(duì)豬源大腸桿菌最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Tab 3 determination results of minimum inhibitory concentrations of five traditional Chinese medicines on Escherichia coli from pigs

3 討論與結(jié)論

3.1 中藥抗菌活性的探討 中藥種類繁多，安全可靠，副作用小，并且可抑制和殺菌，本實(shí)驗(yàn)選擇的金銀花既能宣熱解毒，還能清解血毒，用于各種熱病，五味子能提高身體免疫力，滋腎等，黃連是清熱燥濕類中藥，魚(yú)腥草屬于清熱解毒藥，赤芍有清涼，活血的作用。對(duì)致病性豬源大腸桿菌的最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果表明，所選中藥都有抑菌效果，其中以金銀花，黃連，五味子抑菌效果明顯，魚(yú)腥草和赤芍相對(duì)較弱。

本實(shí)驗(yàn)采取傳統(tǒng)的煎藥方法對(duì)所選中藥的有效成分進(jìn)行提取，然后用平皿打孔法來(lái)對(duì)中藥抗菌活性進(jìn)行測(cè)定，其中魚(yú)腥草對(duì)豬源大腸桿菌具有抑菌效果，且其最小抑菌濃度為500 mg/mL，但韋嬪等[4]采用改良的肉湯二倍稀釋法測(cè)定的魚(yú)腥草對(duì)豬源致病性大腸桿菌EC1,EC2,EC3,EC4,EC5最小抑菌濃度均大于500 mg/mL，及對(duì)所測(cè)的致病菌沒(méi)有抑菌效果，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果不符，與杜銀忠所報(bào)道的結(jié)果[5]也不符；他們實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的黃連對(duì)致病菌EC3,EC5最小抑菌濃度均為250 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的黃連的最小抑菌濃度200 mg/mL差別不大，但是對(duì)豬源致病性大腸桿菌EC1,EC2,EC4的最小抑菌濃度(mg/mL)為500，125，500，與本實(shí)驗(yàn)差異比較大，黃連對(duì)臨床上的大腸桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，這與黃玲等所報(bào)道的結(jié)果[6]一致；同時(shí)他們實(shí)驗(yàn)測(cè)的金銀花對(duì)致病菌EC4的最小抑菌濃度為250 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)的金銀花的最小抑菌濃度200 mg/mL相差不大，但是對(duì)與EC1,EC2,EC3,EC5的最小抑菌濃度均為500 mg/mL相差很大，同時(shí)金銀花在體外對(duì)豬源大腸桿菌的抑菌效果與陳希文等的報(bào)道[7]一致，但是與劉榮欣的報(bào)告[8]不同。所以，不同藥劑對(duì)同一種致病菌的抗菌活性可能不同，這可能是有效成分不同的原因；并且同種名字的致病菌也有不同的類型，也會(huì)導(dǎo)致同種中藥出現(xiàn)不同抗菌活性的情況，這可能是同種致病菌接受中藥作用效果不同的原因；并且不同人對(duì)同一種中藥對(duì)同一種病原菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不相同，這可能是不同地區(qū)中藥成分有差異，采摘季節(jié)，提取方法不同造成的。

細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越受關(guān)注，并且耐藥菌株發(fā)展也越來(lái)越快，降低或消除大腸桿菌的耐藥性，使其部分或者全部恢復(fù)敏感性，對(duì)于臨床治療細(xì)菌感染及防止耐藥菌株的傳播有很大的意義，并且對(duì)人類的安全問(wèn)題有很大意義。

本實(shí)驗(yàn)用5種藥敏片來(lái)測(cè)定所選中藥對(duì)于豬源大腸桿菌的逆轉(zhuǎn)耐藥性問(wèn)題，用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，所選中藥均具有逆轉(zhuǎn)致病性豬源大腸桿菌耐藥性的作用，這與韋嬪[2]等測(cè)定的黃連，金銀花，魚(yú)腥草對(duì)致病性大腸桿菌慶大霉素耐藥性的消除率均高于SDS對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，同時(shí)蘆亞君等[9]測(cè)定三種方劑逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)觀察中3種方劑與未經(jīng)任何逆轉(zhuǎn)的大腸桿菌都有顯著性差異，而其中三黃湯和五味消毒飲的主要成分分別有黃連和金銀花，也與本實(shí)驗(yàn)的顯著性差異結(jié)果想吻合。但是根據(jù)抑菌圈直徑可以看出，同種中藥對(duì)同種致病菌的逆轉(zhuǎn)效果可能不同，這可能是時(shí)間影響其逆轉(zhuǎn)耐藥性的原因，隨著時(shí)間的改變，其逆轉(zhuǎn)耐藥性也會(huì)逐漸改變；而且，本實(shí)驗(yàn)用四種藥敏片測(cè)的逆轉(zhuǎn)耐藥性效果也不盡相同，這可能說(shuō)明中藥成分對(duì)不同的抗生素有不同的效果。目前來(lái)說(shuō)，中藥消除細(xì)菌耐藥性的機(jī)制仍然比較復(fù)雜，但是篩選開(kāi)發(fā)出抑菌效果好、耐藥性消除率高的中草藥依然是控制耐藥性發(fā)展的有效方法。

3.2 各種因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的影響 通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)與相關(guān)研究進(jìn)行比較，分析得出這些差別可能與本實(shí)驗(yàn)采取的中藥提取方法、提取條件、培養(yǎng)基的制備、菌種的來(lái)源、菌懸液的濃度有關(guān)，還可能與環(huán)境因素，中藥的產(chǎn)地，采摘季節(jié)等有關(guān)，并且可能和培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間甚至濕度的不同，都會(huì)對(duì)抑菌效果產(chǎn)生不同影響，這都有待進(jìn)一步研究。此次實(shí)驗(yàn)只是檢測(cè)各中草藥對(duì)大腸桿菌這種供試菌在體外有無(wú)抗菌作用及其逆轉(zhuǎn)性效果，而在體內(nèi)是否具有抗菌活性和逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用尚未可知，需要進(jìn)一步研究。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為其進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。