王慶紅，孫真崢，廖 歡，謝麗麗，陳錫龍，趙 貴

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所,貴陽 550003)

磺胺類藥物是一類應用普遍、效果良好的抗菌藥物[1-3]，復方磺胺嘧啶鈉注射液在養(yǎng)殖場中被大規(guī)模使用，不僅能夠治療畜禽的疾病[4-5]，而且還能增強畜禽的體質；在畜產品中獸藥殘留最大限量規(guī)定，磺胺最大殘留量不超過100 μg/kg[6]。如使用不當、濫用或不遵守休藥期, 將會產生獸藥殘留[7-9]；同時獸藥質量沒有好的檢測方法進行監(jiān)管，也會給養(yǎng)殖行業(yè)帶來較大的危害[10]。

復方磺胺嘧啶鈉注射液主要含有磺胺嘧啶和甲氧芐啶兩個組分，在《中國獸藥典》中測定磺胺嘧啶的含量使用的是“永停滴定法”，而測定甲氧芐啶使用的是“紫外-可見分光光度法”[11-12]，但檢測繁瑣，有機試劑較多，對人的身體傷害極大。

基于以上幾點，建立一種既能快速定性定量檢測，又對人身體傷害較小的方法很有必要。利用高效液相色譜儀對復方磺胺嘧啶鈉注射液進行檢測，一次性能夠測定兩個組分，并且定量準確，操作簡便。目前高效液相色譜儀測定復方磺胺嘧啶鈉注射液幾乎沒有研究，因此建立高效液相色譜法測定復方磺胺嘧啶鈉注射液不僅對獸藥監(jiān)管很有必要，而且對畜禽產品質量起到重要保障[13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備 Denver instrument TB-215 D型電子分析天平(美國丹佛公司)；Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測器)；

1.1.2 對照品 ①磺胺嘧啶對照品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：H0361504，含量99.5%；甲氧芐啶對照品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：H0161210，含量100.0%。

②原料藥：磺胺嘧啶鈉：洛陽市正牧生物科技有限公司；批準文號：獸藥原字162441631；批號：20180301；生產日期：20180308；含量：99.8%。甲氧芐啶：壽康富康制藥有限公司；批準文號：國藥準字H37020335；批號：A-10111710094；生產日期：20171031；含量：99.3%。

1.1.3 試驗樣品 收集了3批不同公司生產的復方磺胺嘧啶鈉注射液制劑樣品，樣品信息見下表：

表1 試驗樣品信息Tab 1 Test sample information

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取磺胺嘧啶對照品約50 mg及甲氧芐啶約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得磺胺嘧啶濃度約為1.00 mg/mL及甲氧芐啶濃度約為0.2 mg/mL的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液5 mL置于50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得磺胺嘧啶濃度約為100 μg/mL及甲氧芐啶濃度約為20 μg/mL的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制 精密量取復方磺胺嘧啶鈉注射液5 mL(10 mL:1.0 g磺胺嘧啶鈉+0.2 g甲氧芐啶)，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。另取上述稀釋液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。再另取第二次稀釋液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 色譜方法 色譜柱:為Waters Symmetry C18(5 μm, 4.6 mm × 250 mm)色譜柱。柱溫40℃；進樣量：20 μL；測定波長240 nm；流動相A(0.1%磷酸溶液)與B(乙腈)85∶15等度洗脫。按外標法以峰面積計算含量，其中，磺胺嘧啶結果乘以1.0878，即為供試品中磺胺嘧啶鈉(C10H9N4NaO2S)的含量。在此色譜條件下，磺胺嘧啶和甲氧芐啶兩主峰附近均沒有明顯的干擾峰，并且對照品溶液和樣品溶液主峰分離度好、保留時間一致，說明該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

2 結果與分析

2.1 線性及范圍 精密量取對照品貯備液20 mL置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含磺胺嘧啶200 μg/mL、含甲氧芐啶40 μg/mL的樣品，依次吸取10 mL到20 mL分別得磺胺嘧啶12.5、

圖1 復方磺胺嘧啶鈉濃度為100 μg/mL對照品和樣品圖譜Fig 1 Chromatograms of reference substance of compound sulfadiazine sodium(100 μg/mL)

25、50、100、200 μg/mL及甲氧芐啶2.5、5、10、20、40 μg/mL的對照品溶液系列，精密吸取各對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以磺胺嘧啶或甲氧芐啶色譜峰面積(Area)，對其相應濃度(Amt，μg/mL)進行線性回歸，求得回歸方程，可知磺胺嘧啶鈉在12.5～200 μg/mL及甲氧芐啶分別為2.5～40 μg/mL內線性關系良好。相關數(shù)據(jù)分別見表2和表3。

2.2 準確度和精密度 按照《中國獸藥典》中藥物回收率添加方法，在已知含量的復方磺胺嘧啶鈉供試品中加入一定質量的磺胺嘧啶和甲氧芐啶原料，使其制備后在供試品中的量為其含量的80%，100%和120%，每個添加水平平行制備3份，其中磺胺嘧啶鈉添加量為200、250、300 mg，甲氧芐啶添加量40、50、60 mg，按照2.2.3的方法測定峰面積，計算實際測得的量(實測值)，用實際測得的量比上樣品的量與加入量的和，即得?；厥章试?8%～101%，準確度符合《中國獸藥典》回收率范圍要求；以變異系數(shù)來衡量精密度，RSD均小于2%，精密度符合《中國獸藥典》關于精密度的要求。

表2 磺胺嘧啶鈉溶液的標準曲線數(shù)據(jù)[14]Tab 2 Standard curve data of sulfadiazine sodium solution

表3 甲氧芐啶的標準曲線數(shù)據(jù)Tab 3 Standard curve data of trimethoprim

表5 磺胺嘧啶鈉回收率測定結果Tab5 Recovery results of sulfadiazine sodium

表6 甲氧芐啶回收率測量結果Tab 6 Recovery results of trimethoprim

2.3 溶液穩(wěn)定性試驗 精密量取含磺胺嘧啶鈉濃度約為100 μg/mL及甲氧芐啶約為20 μg/mL的樣品溶液20 μL，分別約于0、24、48 h上機測定，每次進樣2針，結果見表7?；前粪奏もc和甲氧芐啶色譜峰面積的相對標準偏差分別為：0.7% 和1.9%，表明此法配置的溶液在48 h內穩(wěn)定。

表7 溶液穩(wěn)定性試驗結果Tab 7 Stability measurement results

3 討論與結論

3.1 流動相比例的選擇[14-15]比較了3種比例的流動相，即0.1%磷酸-乙腈(80∶20)、(85∶15)和(90∶10)，其中0.1%磷酸-乙腈(80∶20)的流動相運行樣品時，磺胺嘧啶色譜峰和甲氧芐啶色譜峰沒有完全分離，0.1%磷酸-乙腈(90∶10)的流動相運行樣品時，磺胺嘧啶色譜峰和甲氧芐啶色譜峰分離較好，但甲氧芐啶色譜峰出峰時間較長30 min。而0.1%磷酸-乙腈(85∶15)時，磺胺嘧啶色譜峰和甲氧芐啶色譜峰分離良好,磺胺嘧啶你和甲氧芐啶的出峰時間分別為6.7 min和8.5 min，故選擇流動相0.1%磷酸-乙腈的比例為85∶15。

3.2 樣品處理溶劑的選擇[16-17]由于磺胺嘧啶，甲氧芐啶在水中都幾乎不溶，在酸中易溶，即分別選擇兩種溶劑比較。溶解分別選用兩種溶劑系統(tǒng)的比較。溶劑一：先加5 mL鹽酸再加流動相定容；溶劑二：前兩步稀釋選用甲醇定容。結果分析：選用溶劑一在操作步驟上要注意細節(jié)，比如加鹽酸到樣品中搖勻后需要立即定容，步驟較繁瑣，選用溶劑二在操作上更簡便。前兩步均用甲醇稀釋的樣品溶解更完全。

利用已建立好的“高效液相色譜法測定復方磺胺嘧啶鈉注射液”對50批復方磺胺嘧啶鈉注射液進行含量測定，方法不僅操作簡便，定量準確，而且能夠一次完成兩個組分的測定，不需要分兩次測定藥物含量，添加回收率范圍在98%～101%，符合《中國獸藥典》的高效液相色譜法添加回收的要求，可以作為《中國獸藥典》復方磺胺嘧啶鈉注射液方法的有效補充，對該類獸藥質量監(jiān)管提供了一種更為有效的檢測手段，為畜產品質量起到保駕護航的作用。