彭國瑞，王秀麗，彭小兵，辛凌翔，張一幟，魏 津，李 建，李旭妮，劉 博，馬 欣，李俊平，張 媛

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

目前，我國用于預(yù)防豬丹毒病的疫苗有豬丹毒活疫苗(GC42或G4T10株)，豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗，豬丹毒滅活疫苗，豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗等產(chǎn)品，有20家左右的企業(yè)生產(chǎn)，年產(chǎn)量近300批2.38億頭份。按照《中華人民共和國獸藥典》2015年版三部(以下簡稱《中國獸藥典》)，豬丹毒疫苗的效力檢驗用攻毒菌為豬丹毒絲菌強(qiáng)毒血清1型C43-8 株和2型C43-6株的混合菌液。常規(guī)方法制備用于疫苗效力檢驗攻毒培養(yǎng)物，需經(jīng)過菌種復(fù)蘇、菌落篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)、菌液活菌預(yù)計數(shù)、毒力測定、菌液活菌復(fù)數(shù)以及攻毒和攻毒菌液計數(shù)等多個步驟[1]，多次強(qiáng)毒菌種的新鮮培養(yǎng)，重復(fù)工作多，檢驗操作周期長，工作量大，而且由于攻毒菌液對環(huán)境溫度敏感，保存條件要求高，保存不當(dāng)常常會導(dǎo)致細(xì)菌死亡，菌數(shù)降低，對檢驗工作存在較大影響。

為此，本研究將豬丹毒檢驗用菌種制成更為易于穩(wěn)定保存和使用的凍干型攻毒培養(yǎng)物，經(jīng)過一次培養(yǎng)制備，用于多批次檢驗，減少強(qiáng)毒的重復(fù)培養(yǎng)，以期在增強(qiáng)檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性的同時，簡化操作步驟，提升檢驗工作效率，為標(biāo)準(zhǔn)品的制備奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌種 豬丹毒絲菌血清1型CVCC43008(C43-8)株和2型CVCC43006(C43-6)株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并保存。

1.2 試劑 肉肝胃消化湯、馬丁肉湯、馬丁瓊脂培養(yǎng)基和蔗糖脫脂奶等購自北京中海生物公司，新生胎牛血清購自GIBCO公司，裂解血細(xì)胞全血由實驗室自制，豬丹毒滅活疫苗、豬丹毒活疫苗(G4T10株)為國內(nèi)兩家企業(yè)生產(chǎn)成品。

1.3 實驗動物 體重18～22 g ICR小鼠購自北京維通利華試驗動物公司。

2 方 法

2.1 復(fù)蘇培養(yǎng) 將豬丹毒凍干菌種CVCC43008株和CVCC43006株安瓿啟封后，用肉肝胃消化湯稀釋，分別劃線接種含10%血清馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。革蘭氏染色鏡檢合格后，各挑取中等大小、表面光滑圓整、呈微藍(lán)灰色露珠狀典型菌落3個，分別接種含2%裂解血細(xì)胞全血肉肝胃消化湯，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h[2]。

2.2 凍干與保存 將2株豬丹毒培養(yǎng)菌液等體積混合后，與含16%蔗糖20%脫脂奶的凍干保護(hù)劑1∶1(V∶V)混勻，2.0 mL/瓶分裝至7 mL裝量的西林瓶內(nèi)，加膠塞，入箱凍干，壓蓋，加鋁帽，制成豬丹毒凍干培養(yǎng)物，于-20 ℃醫(yī)用冷藏箱保存待檢定。

2.3 性狀觀察 肉眼觀察凍干培養(yǎng)物在瓶內(nèi)的狀態(tài)，輕輕振蕩是否易于瓶壁脫離，以及加稀釋液后的溶解情況。

2.4 純粹檢驗 隨機(jī)抽取5瓶用含10%血清馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，按《中國獸藥典》附錄3306進(jìn)行純粹檢驗[3]。

2.5 真空度與剩余水分測定 -20 ℃保存18個月后，隨機(jī)取4瓶，測定真空度和剩余水分含量。

2.6 活菌計數(shù)方法 將凍干培養(yǎng)物用馬丁肉湯適當(dāng)比例梯度稀釋后，用含10%血清的馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，按《中國獸藥典》附錄3405進(jìn)行活菌計數(shù)。

2.7 瓶間活菌數(shù)均一性試驗 隨機(jī)取10瓶凍干培養(yǎng)物，分別進(jìn)行活菌計數(shù)，比較瓶間活菌數(shù)差異。

2.8 短時間存放溫度對活菌數(shù)的影響 模擬實際攻毒使用時可能短期存放的溫度條件，研究短期存放溫度對活菌數(shù)的影響。隨機(jī)取18瓶凍干培養(yǎng)物，分別在37 ℃、25 ℃、室溫(20～25 ℃)、4 ℃、簡易冰盒(隨時間溫度逐步從-20 ℃升高到-1 ℃)等溫度條件下各存放3瓶，2.5～3.0 h后進(jìn)行活菌計數(shù)。

2.9 低溫長期保存活菌數(shù)和毒力監(jiān)測 凍干培養(yǎng)物-20 ℃保存1、3、6、9、12、18和36個月后，分別隨機(jī)取3瓶，進(jìn)行活菌計數(shù)，按照3.6×109CFU/瓶的預(yù)估活菌數(shù)，用肉肝胃消化湯將凍干培養(yǎng)物稀釋至8 CFU/0.2mL，冰浴保存，在2 h內(nèi)使用。0.2 mL/只腹股溝皮下注射體重18～22 g ICR小鼠各5只，觀察7 d[2]。同時進(jìn)行活菌計數(shù)，確認(rèn)實際攻毒劑量[4]。

2.10 在豬丹毒疫苗檢驗中的應(yīng)用

2.10.1 疫苗免疫與攻毒 按照《中國獸藥典》豬丹毒滅活疫苗和豬丹毒活疫苗效力檢驗方法，將商品化豬丹毒滅活疫苗和豬丹毒活疫苗免疫小鼠，分別采用本方法和常規(guī)方法制備的攻毒培養(yǎng)物稀釋后攻擊小鼠進(jìn)行效力檢驗[2]。

2.10.2 凍干培養(yǎng)物制備攻毒菌液 隨機(jī)取同批次制備保存36個月凍干培養(yǎng)物3瓶，其中1瓶進(jìn)行活菌計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將第2瓶稀釋至10、8、6、4、2 CFU/0.2mL，冰浴保存，在2 h內(nèi)使用，0.2 mL/只腹股溝皮下注射體重18～22 g ICR小鼠各5只，觀察7 d，同時進(jìn)行活菌計數(shù)，計算實際測毒小鼠1 MLD活菌數(shù)。按照測毒結(jié)果將第3瓶稀釋后制成攻毒菌液攻毒，同時進(jìn)行活菌計數(shù)，計算實際攻毒劑量。

2.10.3 常規(guī)培養(yǎng)制備攻毒菌液 開啟豬丹毒絲菌C43008株和C43006株菌種各1支，肉肝胃消化湯溶解后，劃線接種含10%血清馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取表面圓整光滑，呈微藍(lán)灰色露珠狀的菌落，兩菌株分別接種含2%裂解血細(xì)胞全血的肉肝胃消化湯37 ℃培養(yǎng)18 h，等體積混勻，3 mL/支分裝，-70 ℃凍存(需在21 d內(nèi)使用)。保存3 d后，取1支進(jìn)行活菌計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，另取1支稀釋至10、8、6、4、2 CFU/0.2mL，冰浴保存，在2 h內(nèi)使用，0.2 mL/只腹股溝皮下注射體重18～22 g ICR小鼠各5只，觀察7 d，同時進(jìn)行活菌計數(shù)，計算實際測毒小鼠1 MLD活菌數(shù)。按照測毒結(jié)果將第3支凍存菌稀釋制成攻毒菌液攻毒，同時進(jìn)行活菌計數(shù)，計算實際攻毒劑量。

3 結(jié)果與分析

3.1 性狀觀察 凍干培養(yǎng)物為海綿狀團(tuán)塊，較易與瓶壁脫離，加馬丁肉湯振搖后2 min內(nèi)溶解。

3.2 純粹檢查 用馬丁肉湯溶解后按照表1所示接種培養(yǎng)基，在25 ℃、37 ℃培養(yǎng)5 d，結(jié)果5/5純粹生長。

表1 純粹檢驗結(jié)果Tab 1 The results of purity test

“-”純粹生長；“+”有雜菌生長；“×”不生長

3.3 真空度與剩余水分測定 凍干培養(yǎng)物真空度測定合格率98.2%。36個月后抽取4瓶真空度檢驗4/4合格，測定剩余水分含量分別為2.7%、1.9%、2.5%和3.2%。

3.4 瓶間活菌數(shù)均一性試驗 10瓶凍干培養(yǎng)物平均活菌數(shù)為3.8×109CFU，變異系數(shù)(C.V)為10.0%(表2)。

表2 均一性試驗結(jié)果Tab 2 The results of uniformity test

3.5 短時間存放溫度對活菌數(shù)的影響 凍干培養(yǎng)物在37 ℃條件下平均活菌數(shù)較低為2.4×109CFU。在25 ℃、室溫、4 ℃、簡易冰盒、-20 ℃等條件下較為穩(wěn)定，變異系數(shù)(C.V)為4.9%(表3)。

表3 短期存放條件對活菌數(shù)的影響Tab 3 The effect of different storage environment on viable count

3.6 低溫長期保存活菌數(shù)和毒力監(jiān)測 在監(jiān)測期內(nèi)凍干培養(yǎng)物活菌數(shù)較為穩(wěn)定，保存12個月變異系數(shù)為3.9%，36個月變異系數(shù)為9.1%(表4)。

表4 低溫長期保存活菌數(shù)和毒力的變化Tab 4 The changes of viable count and virulence in low temperature storage environment

3.7 在豬丹毒疫苗效力檢驗中的應(yīng)用

3.7.1 測毒結(jié)果 表5所示，本方法制備的凍干培養(yǎng)物小鼠1 MLD含活菌數(shù)為5 CFU，常規(guī)方法為4 CFU。

3.7.2 檢驗結(jié)果 表6所示，本方法與常規(guī)方法制備的攻毒培養(yǎng)物應(yīng)用于疫苗檢驗結(jié)果一致。

表5 豬丹毒疫苗效力檢驗測毒結(jié)果Tab 5 The results of toxicity test in potency testing of Erysipelas Bacterins

表6 豬丹毒疫苗效力檢驗結(jié)果Tab 6 The results of potency testing of Erysipelas Bacterins

4 討論與結(jié)論

本研究將疫苗檢驗用豬丹毒絲菌CVCC43008株和CVCC43006株培養(yǎng)物混合制成凍干型攻毒制劑，通過短時間存放溫度對活菌數(shù)的影響實驗，模擬了實際攻毒稀釋前培養(yǎng)物可能短期存放的環(huán)境溫度和條件，其活菌數(shù)在25 ℃、室溫、4 ℃、簡易冰盒、-20 ℃等條件下均較為穩(wěn)定。因此，該凍干培養(yǎng)物在使用時不應(yīng)暴露于高溫環(huán)境，盡量在恒溫較低溫度條件下保存并使用。同時，這種凍干培養(yǎng)物在一定時間內(nèi)可以長期穩(wěn)定保存，經(jīng)活菌數(shù)和毒力監(jiān)測，能夠滿足檢驗攻毒使用，將其應(yīng)用于豬丹毒疫苗的效力檢驗，多批次檢驗使用一次培養(yǎng)菌液，大大減少了強(qiáng)毒的重復(fù)培養(yǎng)，避免了攻毒菌液不易保存、細(xì)菌容易死亡、毒力易減弱等不足，也有利于提高檢驗的可重復(fù)性，保證檢驗結(jié)果的一致性、穩(wěn)定性和檢驗成功率，降低了檢驗工作量，提高了效率，為豬丹毒疫苗效力檢驗攻毒用培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)品的制備提供了試驗基礎(chǔ)。

下一步，可以將本研究制備的豬丹毒絲菌凍干培養(yǎng)物制成效力檢驗攻毒標(biāo)準(zhǔn)品在三個層次上應(yīng)用于豬丹毒疫苗的效力檢驗。一是在一次檢驗中，對該凍干培養(yǎng)物進(jìn)行預(yù)活菌計數(shù)，根據(jù)預(yù)計數(shù)結(jié)果梯度稀釋后，注射實驗動物小鼠或本動物豬進(jìn)行測毒，然后對待檢疫苗免疫組和對照組動物攻毒來評價疫苗的免疫效力；二是該凍干培養(yǎng)物所含活菌數(shù)在監(jiān)測使用期內(nèi)穩(wěn)定(在活菌計數(shù)方法偏差范圍內(nèi))，在一次檢驗中，按照監(jiān)測標(biāo)定的活菌數(shù)，測毒后即可攻毒；三是該凍干培養(yǎng)物活菌數(shù)和毒力在使用期內(nèi)均穩(wěn)定，在一次使用標(biāo)準(zhǔn)實驗動物小鼠檢驗中，不進(jìn)行活菌計數(shù)和測毒，根據(jù)標(biāo)定的活菌數(shù)和毒力，按照固定比例稀釋后，直接對待檢疫苗組和對照組實驗動物進(jìn)行攻毒。