肖懷秋，李玉珍，趙謀明，林親錄，劉 軍，周 全，姜明姣

(1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000； 2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640； 3.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004； 4.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生肽亞鐵(peanut peptide-ferrous，PPF)，自制，制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]；胃蛋白酶(5 500 U/g)、胰蛋白酶(3 500 U/g)，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱，天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；HERMLE Z323K冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hermle公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生肽亞鐵的人胃腸仿生消化過(guò)程

參考Cruz-Huerta等[10]方法并做修改。準(zhǔn)確稱取10.0 mg花生肽亞鐵于1 000 mL胃仿生消化液中，(37±0.5)℃、100 r/min胃仿生消化2 h，每間隔30 min取樣15 mL于8 000 r/min離心20 min，上清液用于抗氧化活性分析，收集的上清液命名為胃仿生消化物(simulated gastro-digesting fractions, SGF)，樣品依次命名為SGF1～ SGF4；用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.6終止胃仿生消化，用十二指腸仿生消化液于(37±0.5)℃、50 r/min仿生消化1 h，每間隔30 min取樣15 mL于8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定抗氧化活性，收集的上清液命名為十二指腸仿生消化物(simulated duodenum-digesting fractions, SDF)，樣品依次命名為SDF1～SDF2；調(diào)節(jié)pH至6.8，繼續(xù)于(37±0.5)℃、50 r/min小腸仿生消化3 h，每間隔30 min取樣15 mL于8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定抗氧化活性，收集的上清液命名為小腸仿生消化物(simulated intestinal-digesting fractions, SIF)，樣品依次命名為SIF1～SIF6。胃腸仿生消化液參考《中國(guó)藥典》配制[11]。

1.2.2 表面疏水性的測(cè)定

準(zhǔn)確移取10 mg/L花生肽亞鐵或仿生消化物1 mL，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)，以磷酸鹽緩沖溶液為對(duì)照，于6 000×g離心15 min，取上清液稀釋10倍，在595 nm下測(cè)定吸光值(A)。表面疏水性用溴酚藍(lán)結(jié)合量表示[12]。

式中：A對(duì)為對(duì)照的吸光值；A樣為樣品的吸光值。

1.2.3 DPPH·清除活性測(cè)定

取3只試管分別加入下述試劑：①10 mg/L花生肽亞鐵或仿生消化物1.5 mL和1.5 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，溶于95%乙醇)；②10 mg/L花生肽亞鐵或仿生消化物1.5 mL和1.5 mL 95%乙醇；③1.5 mL DPPH溶液和1.5 mL蒸餾水。振蕩混勻后在室溫下避光靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液于517 nm測(cè)定吸光值。3個(gè)反應(yīng)液的吸光值分別為A1、A3和A2。按下式計(jì)算DPPH·清除率。

DPPH·清除率= [1-(A1-A3)/A2]×100%

式中：S對(duì)照為對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；S樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min。

1.2.5 ·OH清除活性測(cè)定

準(zhǔn)確移取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)和0.5 mL去離子水，充分混勻后，加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，混勻后，加入0.5 mL 0.01%雙氧水作為損傷管，于37℃水浴60 min后于536 nm測(cè)定吸光值(A損)；未損傷管以0.5 mL蒸餾水代替損傷管中0.5 mL雙氧水，于536 nm測(cè)定吸光值(A未)；樣品管以0.5 mL樣品代替損傷管中0.5 mL蒸餾水，于536 nm測(cè)定吸光值(A樣)[13]。按下式計(jì)算·OH清除率。

·OH清除率=(A樣-A損)/(A未-A損)×100%

1.2.6 亞油酸氧化抑制活性測(cè)定

準(zhǔn)確移取10 mg/L花生肽亞鐵或仿生消化物3.0 mL，加入2.0 mL 0.05 mol/L亞油酸-乙醇溶液，充分混勻，用硅膠塞密封并于60℃保溫，每12 h取反應(yīng)液0.1 mL，加入4.7 mL 75%乙醇、0.1 mL 30%硫氰酸銨和0.1 mL 0.02 mol/L FeSO4(3.5%HCl溶液)，混合均勻，5 min后于500 nm測(cè)定吸光值(A500)[13]。

1.2.7 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性測(cè)定

構(gòu)建以卵黃脂蛋白為底物的脂質(zhì)過(guò)氧化模型進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性評(píng)價(jià)。樣品管包括1∶25稀釋的卵黃懸液(卵黃用等體積pH 7.45、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶物(PBS)配制，4℃保存，用前搖勻)0.2 mL花生肽亞鐵或仿生消化物1.0 mL，用PBS補(bǔ)足至2.0 mL；對(duì)照管提前加入0.5 mL 20%三氯乙酸(TCA)溶液，并加入除樣液外其他試劑。將上述兩管同時(shí)于(37±0.5)℃保溫60 min，取出后，樣品管加入0.5 mL 20% TCA溶液，靜置15 min后，與對(duì)照管一并于3 500 r/min離心10 min。分別取上清液2.0 mL，加入0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0 mL，加塞于100℃水浴20 min，取出冷卻至室溫；以空白管調(diào)零(空白管以2.0 mL PBS代替)，于532 nm測(cè)定吸光值[14]。按下式計(jì)算脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)抑制率。

LPO抑制率=(A對(duì)-A樣)/A對(duì)×100%

式中：A對(duì)為對(duì)照管的吸光值；A樣為樣品管的吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵表面疏水性的影響(見(jiàn)表1)

表1 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵表面疏水性的影響

注：相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

由表1可以看出：當(dāng)胃仿生消化30 min時(shí)，花生肽亞鐵胃仿生消化物的表面疏水性與未仿生消化的花生肽亞鐵表面疏水性差異不顯著，胃仿生消化120 min時(shí)表面疏水性顯著增加至(11.46±0.41)μg；十二指腸仿生消化階段表面疏水性增幅不顯著；仿生消化270 min時(shí)，表面疏水性達(dá)到最大((15.84±0.33)μg)，繼續(xù)進(jìn)行小腸仿生消化，表面疏水性變化不顯著，說(shuō)明仿生消化270 min時(shí)疏水性基團(tuán)已充分暴露。研究表明，多肽疏水基團(tuán)暴露有利于發(fā)揮其抗氧化活性[15-16]。

2.2 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵DPPH·清除活性的影響(見(jiàn)表2)

表2 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵DPPH·清除活性的影響

由表2可以看出：VC質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)DPPH·清除率為(73.50±0.29)%，VC質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，DPPH·清除率增加不顯著；花生肽亞鐵及其仿生消化物具有較好的DPPH·清除活性，未仿生消化的花生肽亞鐵DPPH·清除率為(78.73±0.94)%，胃仿生消化120 min時(shí)，DPPH·清除率顯著增加到(82.53±1.18)%，十二指腸仿生消化DPPH·清除率變化不顯著，小腸仿生消化240 min時(shí)，DPPH·清除率顯著增加到(87.97±0.81)%，進(jìn)一步延長(zhǎng)小腸仿生消化時(shí)間，DPPH·清除率不再顯著性增加，其可能原因是DPPH·是脂溶性自由基，疏水性較強(qiáng)的多肽常具有較高DPPH·清除活性[15]。

2.3 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵清除活性的影響(見(jiàn)表3)

表3 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵清除活性的影響

2.4 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵·OH清除活性的影響(見(jiàn)表4)

由表4可以看出：VC質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，·OH清除率達(dá)到(98.84±0.41)%；未仿生消化的花生肽亞鐵·OH清除率為(65.94± 0.45)%，胃仿生消化120 min，·OH清除率顯著上升至(72.36±0.66)%，十二脂腸仿生消化完成后，·OH 清除率提升到(78.64±0.52)%，隨后的小腸仿生消化進(jìn)一步提升了消化物的·OH清除率，仿生消化300 min時(shí)·OH清除率顯著增加到(83.13±0.52)%，繼續(xù)進(jìn)行小腸仿生消化，·OH清除率增幅不顯著，相比VC(0.6～1.0 mg/mL)對(duì)·OH的清除效果，花生肽亞鐵及其仿生消化物的·OH清除能力較弱。

表4 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵·OH清除活性的影響

2.5 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵亞油酸氧化抑制活性的影響(見(jiàn)表5)

表5 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵亞油酸氧化抑制活性的影響

注：CK為亞油酸；不同小寫(xiě)字母表示同列間比較具有顯著差異(p<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示同列間比較不具有顯著差異(p>0.05)，下同。

2.6 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性的影響(見(jiàn)表6)

表6 胃腸仿生消化對(duì)花生肽亞鐵脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性的影響

3 結(jié) 論