楊 靜, 張曉燕，洪 玲，沈 娜，黃 力，許艷霞

(1.湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410201; 2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410201)

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在農(nóng)作物中主要是以AFB1、AFB2、AFG1及AFG24種形式存在。黃曲霉毒素具有致癌、致畸和引起肝臟損傷的作用[1-2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其確定為1類致癌物，世界各國(guó)和地區(qū)均對(duì)其在各類食品中制定了限量標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。因此，為實(shí)現(xiàn)食品中黃曲霉毒素的有效監(jiān)管，確保食品安全，對(duì)食品中黃曲霉毒素進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)顯得十分關(guān)鍵。

目前，黃曲霉毒素準(zhǔn)確定量的方法主要有柱后光化學(xué)衍生HPLC法[6]、柱后碘衍生HPLC法[7]及無(wú)衍生UPLC法[8]等。柱后光化學(xué)衍生HPLC法無(wú)需特殊的化學(xué)試劑，在線衍生，操作簡(jiǎn)單，易進(jìn)行批量樣品的檢測(cè)；柱后碘衍生HPLC法檢測(cè)靈敏度高；無(wú)衍生UPLC法因采用高壓泵、色譜柱小顆粒技術(shù)和高靈敏度熒光檢測(cè)器，從而無(wú)需衍生，AFB1和AFG1均能被檢測(cè)、定量，其耗時(shí)短、流動(dòng)相用量少、進(jìn)樣量低。由于植物油中黃曲霉毒素含量低，并且存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象，常采用免疫親和柱凈化等凈化方法[9-11]處理樣品。免疫親和柱凈化是采用上樣、純甲醇洗脫的方式，由于洗脫液中有機(jī)相比例過(guò)高，常采用氮吹的方法揮去過(guò)多的有機(jī)溶劑，再用流動(dòng)相復(fù)溶。在氮吹過(guò)程中，黃曲霉毒素也可能揮發(fā)，從而造成樣品測(cè)定值偏低[12]，且氮吹過(guò)程耗時(shí)。

因此，本文對(duì)樣品的前處理?xiàng)l件進(jìn)行改進(jìn)，采用不氮吹和50%甲醇溶液進(jìn)樣，采用柱后光化學(xué)衍生HPLC法、柱后碘衍生HPLC法及無(wú)衍生UPLC法，在改進(jìn)的色譜條件下同時(shí)檢測(cè)植物油中4種黃曲霉毒素的含量，并從線性關(guān)系、檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、實(shí)際樣品檢測(cè)等方面對(duì)這3種改進(jìn)方法進(jìn)行了分析和比較，以探討其對(duì)植物油中黃曲霉毒素檢測(cè)的適用性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Sigma公司)，黃曲霉毒素B1/B2/G1/G2免疫親和柱(北京華安麥科生物技術(shù)有公司)，乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)，超純水，陽(yáng)性花生油(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局比對(duì)考核樣)，大豆油(黃曲霉毒素未檢出，市售)，氯化鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，Whatman 934-AH微纖維濾紙。

Agilent 1260高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Agilent公司)，Waters acquity UPLC 超高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司)，光衍生器(230 V, 50 Hz,8 W,美國(guó)Aura Industries公司 )，柱后碘衍生系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)，明澈-D24uv超純水機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

取質(zhì)量濃度為0.28 μg/mL AFG2、0.88 μg/mL AFG1、0.32 μg/mL AFB2、1.02 μg/mL AFB1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并將其稀釋配成質(zhì)量濃度分別為梯度1 (0.14 ng/mL AFG2、0.44 ng/mL AFG1、0.16 ng/mL AFB2、0.51 ng/mL AFB1)、梯度2 (0.28 ng/mL AFG2、0.88 ng/mL AFG1、0.32 ng/mL AFB2、1.02 ng/mL AFB1)、梯度3 (0.56 ng/mL AFG2、1.76 ng/mL AFG1、0.64 ng/mL AFB2、2.04 ng/mL AFB1)、梯度4 (1.40 ng/mL AFG2、4.40 ng/mL AFG1、1.60 ng/mL AFB2、5.10 ng/mL AFB1)、梯度5 (2.80 ng/mL AFG2、8.80 ng/mL AFG1、3.20 ng/mL AFB2、10.20 ng/mL AFB1)、梯度6 (4.20 ng/mL AFG2、13.20 ng/mL AFG1、4.80 ng/mL AFB2、15.30 ng/mL AFB1)、梯度7 (5.60 ng/mL AFG2、17.60 ng/mL AFG1、6.40 ng/mL AFB2、20.40 ng/mL AFB1)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，且標(biāo)準(zhǔn)工作液使用50%甲醇定容。

1.2.2 改進(jìn)的樣品前處理

稱取試樣(5 .00 g)→加入氯化鈉(1.0 g)→加入甲醇水溶液提取液(25 mL，體積分?jǐn)?shù)70%)→渦旋混勻→搖床浸提(200～ 300 r/min， 20 min)→離心分離(4 000 r/min， 5 min)→取上層清液(10 mL)→加入去離子水稀釋(20 mL)→渦旋混勻→微纖維濾紙過(guò)濾→收集濾液→免疫親和柱凈化(15.0 mL)→去離子水洗滌(10 mL/次，2次)→甲醇洗脫(1.0 mL)→收集洗脫液→水稀釋定容至2.0 mL→微孔濾器過(guò)濾(0.22 μm)→高效液相色譜分析。

1.2.3 改進(jìn)的色譜條件(見(jiàn)表1)

表1 3種分析方法的優(yōu)化色譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 柱后衍生和無(wú)衍生的比較

取質(zhì)量濃度為梯度5 (2.80 ng/mL AFG2、8.80 ng/mL AFG1、3.20 ng/mL AFB2、10.20 ng/mL AFB1)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，4種黃曲霉毒素的譜圖見(jiàn)圖1、圖2。陽(yáng)性花生油樣按照1.2.2進(jìn)行樣品前處理，按照1.2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，4種黃曲霉毒素的譜圖見(jiàn)圖3。

圖1 無(wú)衍生UPLC法測(cè)定4種黃曲霉毒素的譜圖(梯度5)

圖2 兩種衍生HPLC法測(cè)定4種黃曲霉毒素的譜圖(梯度5)

由圖1可見(jiàn)，無(wú)衍生UPLC法的4種黃曲霉毒素均能在5 min內(nèi)分離，且分離度較好，但仍存在AFB1、AFG1的熒光強(qiáng)度低于AFB2、AFG2，但不影響其定量的要求。由圖2可見(jiàn)，柱后光化學(xué)衍生HPLC法和柱后碘衍生HPLC法都能提高AFB1、AFG1的熒光強(qiáng)度，柱后碘衍生HPLC法尤其突出，且4種黃曲霉毒素均能達(dá)到較好的分離與定量?？傊蠊饣瘜W(xué)衍生HPLC法能在線衍生、操作簡(jiǎn)便，適合處理大批量樣品，柱后碘衍生HPLC法檢測(cè)靈敏度高，無(wú)衍生UPLC法適用于植物油中黃曲霉毒素的快速定量測(cè)定。由圖3可見(jiàn)，采用前處理不氮吹、50%甲醇溶液環(huán)境下直接上樣，進(jìn)行液相色譜分析，花生油樣中4種黃曲霉毒素均能較好地被分離、定量，同時(shí)節(jié)省了時(shí)間。

圖3 陽(yáng)性花生油樣中4種黃曲霉毒素的譜圖(柱后碘衍生HPLC法)

2.2 線性關(guān)系和檢出限的比較

按照1.2.1取AFG2、AFG1、AFB2和AFB17個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)樣3次。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，考察4種黃曲霉毒素的線性范圍，并以S/N=3、S/N=10分別為4種黃曲霉毒素的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)：柱后光化學(xué)衍生HPLC法4種黃曲霉毒素的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，柱后碘衍生HPLC法的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 8，無(wú)衍生UPLC法的相關(guān)系數(shù)均大于0.997 1，可見(jiàn)3種方法測(cè)定4種黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均良好；柱后碘衍生HPLC法的檢出限和定量限最低，無(wú)衍生UPLC法的最高，充分驗(yàn)證了柱后碘衍生HPLC法具有較高的檢測(cè)靈敏度，但3種方法均能滿足檢測(cè)的需求。

表2 不同方法中4種黃曲霉毒素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 回收率和精密度的比較

將大豆油樣品分成3份，其中1份作本底，另外2份分別加入按1.2.1配制的梯度2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液14.0 μL和60.0 μL，按照本文改進(jìn)的方法進(jìn)行處理和測(cè)定，每份樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，考察方法的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，3種分析方法測(cè)得加標(biāo)回收率為90.7% ～ 116.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%，表明3種方法準(zhǔn)確性良好。

表3 不同方法大豆油中4種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)的比較

利用已改進(jìn)的3種檢測(cè)分析方法對(duì)考核花生油樣進(jìn)行3次平行測(cè)定，結(jié)果取平均值，見(jiàn)表4。由表4可看出，3種方法均能準(zhǔn)確地測(cè)定花生油中4種黃曲霉毒素的含量，與其比對(duì)考核驗(yàn)證結(jié)果一致。

表4 不同方法中實(shí)際樣品4種黃曲霉毒素 檢測(cè)結(jié)果的比較 μg/kg

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)優(yōu)化樣品前處理和色譜條件，采用柱后光化學(xué)HPLC法、柱后碘衍生HPLC法及無(wú)衍生UPLC法測(cè)定了植物油中4種黃曲霉毒素的含量并進(jìn)行了比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用前處理不氮吹、50%甲醇溶液環(huán)境下直接上樣進(jìn)行液相色譜分析，油樣中4種黃曲霉毒素均能被較好分離、定量，并簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程。柱后光化學(xué)衍生HPLC法、柱后碘衍生HPLC法及無(wú)衍生UPLC法中AFB1的檢出限分別為0.035、0.018、0.045 μg/kg，AFB2的檢出限分別為0.016、0.014、0.017 μg/kg，AFG1的檢出限分別為0.067、0.024、0.080 μg/kg，AFG2的檢出限分別為0.029、0.026、0.029 μg/kg；3種分析方法線性關(guān)系良好(r2>0.99)，回收率為90.7%～116.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于12%；3種分析方法測(cè)得花生油樣品中4種黃曲霉毒素的含量基本一致；柱后光化學(xué)衍生HPLC法易于批量樣品檢測(cè)，柱后碘衍生HPLC法檢測(cè)靈敏度高，無(wú)衍生UPLC法檢測(cè)耗時(shí)短，3種方法能夠滿足糧油檢測(cè)工作的需要，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。