王 榮，趙 佳，馮 怡，秦 蓓

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021)

黑芝麻為胡麻科芝麻的種子，具有藥食同源的特性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑芝麻具有抗衰老、降壓、促進(jìn)黑素生成等多種藥理活性，而這些藥理活性主要與其抗氧化作用有關(guān)[1]。黑芝麻富含木脂素、多酚、不飽和脂肪酸、黃酮等生物活性成分[2]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道黑芝麻中木脂素的抗氧化作用[3]，張伶俐[4]研究了芝麻油對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，但以上研究并不能完全解析黑芝麻抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)。已有研究表明黃酮類化合物具有抗氧化活性[5-6]，但黑芝麻中黃酮的抗氧化作用還未見報(bào)道。自由基損傷是目前被科學(xué)界所共識(shí)的衰老機(jī)制。皮下注射D-半乳糖是經(jīng)典的衰老造模方法[7-8]，該模型通過(guò)連續(xù)大劑量注射D-半乳糖造成小鼠體內(nèi)糖代謝紊亂[9]，目前認(rèn)為該模型最接近自然衰老的規(guī)律。D-半乳糖能夠改變腦內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，使自由基清除減緩，過(guò)量的自由基引起機(jī)體衰老。生物體內(nèi)存在清除自由基的酶系，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等。該酶系可通過(guò)氧化還原反應(yīng)將自由基氧化，而抗氧化酶系會(huì)隨機(jī)體年齡增加而減弱。丙二醛(MDA)是活性氧損傷細(xì)胞線粒體系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物，被認(rèn)為是衰老模型重要的指標(biāo)[10]。脾臟和胸腺是機(jī)體的主要淋巴器官，D-半乳糖連續(xù)大劑量注射可引起脾臟和胸腺初始T細(xì)胞水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致免疫老化[11]。本研究通過(guò)D-半乳糖注射構(gòu)建小鼠衰老模型，選擇通過(guò)檢測(cè)小鼠臟器指數(shù)以及小鼠血清和腦組織中的總SOD、GSH-Px活性和MDA含量變化，研究黑芝麻中黃酮的體內(nèi)抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑芝麻，購(gòu)自西安貝斯特藥材市場(chǎng)。采用超聲提取法提取黑芝麻總黃酮，提取條件為65%乙醇、料液比1∶33、超聲時(shí)間50 min，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度法測(cè)得總黃酮得率為1.65%。

雄性昆明小鼠48只，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重(20±2)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(川)2015-030。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)Y16M9S61523，含量98%)，上海源葉生物科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒、BCA法蛋白定量測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

1510型自動(dòng)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific；AX224ZH型分析天平，奧豪斯儀器有限公司；YLS-4C型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；T10型手持勻漿機(jī)，IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組建立衰老模型

48只雄性昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，分為兩組，空白組8只，其余為模型組?？瞻捉M頸部皮下注射生理鹽水，模型組頸部皮下注射D-半乳糖(0.5 g/kg)，注射劑量為0.1 mL/10 g，注射30 d。建模成功后將40只模型小鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、陽(yáng)性組(VC，200 mg/kg)、黑芝麻總黃酮高劑量組(300 mg/kg)、中劑量組(150 mg/kg)和低劑量組(75 mg/kg)，灌胃劑量10 mL/kg，灌胃時(shí)間21 d。

1.2.2 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定

給藥過(guò)程中觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況及皮膚毛發(fā)狀況；利用轉(zhuǎn)棒式疲勞儀和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)能力，記錄小鼠在棒與負(fù)重游泳時(shí)間，將各組進(jìn)行比較。

1.2.3 臟器指數(shù)測(cè)定

脫頸處死小鼠，分離出胸腺、脾臟及腦，用濾紙吸去表面的血，然后進(jìn)行稱量，記錄稱取的質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

小鼠眼眶取血，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液得血清。取腦組織，加冷藏的生理鹽水制備成10%的腦組織勻漿液，取上清液，-20℃冷藏備用。按照說(shuō)明書對(duì)血清和腦組織勻漿液的T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 病理學(xué)觀察

取部分腦組織塊，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色后，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用Oneway-ANOVA Dunnett雙側(cè)t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老小鼠行為學(xué)的影響 (見表1)

注：與空白組相比，*表示P<0.05；與模型組相比，#表示P<0.05。下同。

衰老模型小鼠出現(xiàn)掉毛、行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象。由表1可知，模型組與空白組相比，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和在棒時(shí)間均顯著縮短(P<0.05)，說(shuō)明衰老造成小鼠運(yùn)動(dòng)能力下降。與模型組相比，陽(yáng)性組能顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和在棒時(shí)間(P<0.05)；黑芝麻總黃酮高、中、低劑量組均能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，其中高劑量組具有顯著差異(P<0.05)，黑芝麻總黃酮高劑量組能延長(zhǎng)小鼠在棒時(shí)間，但與模型組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老小鼠臟器指數(shù)的影響 (見表2)

表2 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù) 和腦指數(shù)的影響

脾臟和胸腺在人體中起重要的免疫作用，二者體積的縮小表明機(jī)體一定程度的衰老。當(dāng)機(jī)體衰老后，一般會(huì)伴隨著腦萎縮，所以取腦、胸腺、脾臟進(jìn)行稱重，計(jì)算其臟器指數(shù)。由表2可知，相較于空白組，模型組胸腺、脾臟和腦指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，VC能增加模型小鼠的胸腺、脾臟和腦指數(shù)，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，黑芝麻總黃酮能增加胸腺、脾臟和腦指數(shù)，其中高劑量組的腦指數(shù)顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，黑芝麻總黃酮能改善小鼠的衰老。

2.3 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老小鼠T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響(見表3、表4)

表3 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老小鼠血清中T-SOD、 GSH-Px活力和MDA含量的影響

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中T-SOD和GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。VC能顯著增加模型小鼠血清中T-SOD和GSH-Px的活力(P<0.05)，對(duì)MDA含量無(wú)顯著影響(P>0.05)；黑芝麻總黃酮高、中、低劑量組與模型組相比，血清中T-SOD和GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)，黑芝麻總黃酮高劑量組顯著降低了MDA的含量(P<0.05)。

表4 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老小鼠腦組織中T-SOD、 GSH-Px活力和MDA含量的影響

由表4可知，與空白組相比，模型組T-SOD和GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，VC顯著增加了模型小鼠腦組織中T-SOD和GSH-Px的活力(P<0.05)，顯著降低了MDA的含量(P<0.05)；黑芝麻總黃酮高、中、低劑量組能顯著升高T-SOD的活力(P<0.05)。黑芝麻總黃酮高、中、低劑量組能增加腦組織中GSH-Px活力，但與模型組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。黑芝麻總黃酮高、中劑量組則顯著降低了MDA的含量(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明黑芝麻總黃酮能夠明顯增強(qiáng)小鼠血清和腦組織中T-SOD和GSH-Px活力，并一定程度降低MDA含量，表明其具有一定的抗氧化能力。

2.4 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老模型小鼠腦組織病理形態(tài)的影響(見圖1)

圖1 黑芝麻總黃酮對(duì)衰老模型小鼠 腦組織病理形態(tài)的影響

由圖1可見，空白組小鼠腦組織細(xì)胞排列有序，模型組小鼠腦組織細(xì)胞排列松散，核固縮。與模型組相比，黑芝麻總黃酮(300 mg/kg)組小鼠腦組織細(xì)胞排列有序，細(xì)胞核清晰，明顯好轉(zhuǎn)。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)建立D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型，評(píng)價(jià)了黑芝麻總黃酮的體內(nèi)抗氧化作用。研究結(jié)果表明：黑芝麻總黃酮能延長(zhǎng)衰老小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，增加腦指數(shù)，改善衰老小鼠腦組織的損傷；黑芝麻總黃酮能顯著增加血清中GSH-Px活力，顯著增加血清和腦組織中T-SOD活力，同時(shí)降低MDA含量。以上結(jié)果表明黑芝麻總黃酮通過(guò)抗氧化發(fā)揮抗衰老活性。