張明菊，孫 青，余 凡

(黃岡師范學院 生物與農業(yè)資源學院，湖北 黃岡 438000)

紫薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]屬旋花科甘薯屬草本植物，薯肉呈紫色至深紫色，是甘薯的一個特殊品種類型，兼有糧食作物、經濟作物和藥用作物的特點，是食品、醫(yī)藥、化工、輕工、紡織等工業(yè)的重要原料。紫薯產量高，用途廣，是一種集藥用、保健、食用為一體的天然食品[1]。紫薯具有普通甘薯豐富的成分和功能外，還含有多糖、黃酮類物質，并且還富含硒元素和花青素，而硒元素，具有預防高血壓、減輕肝機能障礙等功能，花青素具備抗氧化、抗突變、降低血壓、保肝護肝、抗癌等多種藥理活性[2]。而紫薯在生產過程中，是用塊根、藤蔓進行無性繁殖的，易受多種病毒的侵染。當病毒在植物體內累積達到一定程度時就會引起產量下降、品質降低、品種退化[3]，嚴重制約了紫薯的生產和推廣應用。

對紫薯進行組培快速繁殖是利用植物組織培養(yǎng)技術來提高繁殖系數，減少病毒危害，從而獲得大量健康的繁殖材料用于大田生產。已有文獻中這方面研究較少。本研究以欣薯2號紫薯催芽得到的頂芽為外植體，對紫薯外植體進行不同滅菌處理，通過探索誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)不同階段激素配比的最佳組合，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，從而建立欣薯2號紫薯組織培養(yǎng)脫毒快速繁殖體系。同時還可以通過組織培養(yǎng)獲取大量紫薯細胞，利用生物反應器提取黃酮、花青素等成分。因此，對紫薯進行組織培養(yǎng)研究，不僅可以建立紫薯快速繁殖體系，實現脫毒苗的工廠化生產[4]，還能為黃酮、花青素等工業(yè)化生產提供重要原料。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

供試材料為黃石市欣野薯業(yè)有限公司提供的欣薯2號紫薯(圖1A)。將欣薯2號紫薯埋種在沙土中(圖1B)，離沙土面2～3 cm，放于恒溫箱中進行催芽，隔1～2 d澆水一次，當幼苗長至20～30 cm時，取其頂芽10～15 cm，剪去較大的葉片，取莖段作為外植體材料(圖1C)。

圖1 欣薯2號紫薯及其組培苗A.紫薯; B.紫薯催芽；C.接種后的莖尖

1.2 培養(yǎng)基的配制

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入不同配比的細胞分裂素/生長素，細胞分裂素使用6-芐氨基嘌呤(6-BA)，生長素用萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)。此外，還在培養(yǎng)基中加入3.0%蔗糖，瓊脂粉的濃度為0.7%。因此，培養(yǎng)基主要成分表示為：MS基本培養(yǎng)基+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂+一定濃度的NAA+一定濃度的6-BA，調節(jié)培養(yǎng)基的pH為5.8。1/2MS表示所有無機鹽濃度減半，其他成分不變；2MS表示所有無機鹽濃度增加一倍，其他成分不變。

1.3 外植體消毒及接種

消毒：用0.1%洗衣粉液洗滌或加幾滴吐溫浸泡5 min，用蒸餾水清洗干凈，置于超凈工作臺上進行滅菌。接種：先在燒杯中用75%酒精浸泡30 s，再用2.5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，最后用無菌水清洗4～5次，在超凈工作臺上用無菌剪刀剪成1 cm左右莖尖接種在誘導培養(yǎng)基中。

1.4 培養(yǎng)條件

將接種好的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2 ℃，每天光照12 h，光照強度1500～2000 lx。

1.5 數據調查統(tǒng)計

外植體按照實驗設計分別接種20個，接種培養(yǎng)后在固定時間內對外植體材料的萌芽率、增殖倍數、生根率等指標作觀察記載并進行統(tǒng)計分析，并據此選擇最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

其中：成苗率=成苗外植體數/接種外植體總數×100%；

出芽率=萌芽外植體數/外植體總數×100%；

生根率=生根苗數/總苗數×100%；

成活率=成活株數/總移栽苗數×100%。

外植體在誘導培養(yǎng)基中，20 d后統(tǒng)計出芽數和萌芽率。每個處理接種10個，重復2次，定期觀察培養(yǎng)物的生長狀況，篩選出適合欣薯2號紫薯誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合。

將增殖培養(yǎng)所得的健壯莖芽，轉接到添加不同濃度NAA和IBA的生根培養(yǎng)基中，每個處理接種10個，重復3次。30 d后記錄根數，并統(tǒng)計生根率。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對紫薯外植體誘導培養(yǎng)的影響

在MS培養(yǎng)基中，首先通過固定NAA濃度0.1 mg·L-1，添加不同濃度的6-BA(0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg·L-1)，形成A1、A2、A3、A4、A5等組合；再通過固定6-BA濃度0.75 mg·L-1，添加不同濃度的NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)，形成B1、B2、B3、B4、B5等組合，觀察不同激素配比的誘導結果(表1)。結果表明，6-BA對欣薯2號紫薯芽萌發(fā)有促進作用，接種后，第7 d后頂芽開始伸長(圖2A)，15 d后葉片展開，葉色濃綠；第7 d后莖段的腋芽也開始萌動，小腋芽點變綠；第14 d后腋芽伸長，葉片展開。

表1 不同6-BA和NAA配比對紫薯莖尖分生組織誘導苗的影響

在固定NAA濃度0.1 mg·L-1時，6-BA濃度為0.75 mg·L-1的培養(yǎng)基對促進頂芽生長的效果最好，出芽率為58%，與對照組相比出芽率增加了1.6倍；但當6-BA濃度達到1.0 mg·L-1時出芽率反而降低(33%)。固定6-BA濃度0.75 mg·L-1，添加不同濃度的NAA時，發(fā)現隨著NAA濃度的提高，出芽率和出根率有下降的趨勢。因此，欣薯2號紫薯莖尖的最佳誘導培養(yǎng)基的組合是：MS+6-BA0.75 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

2.2 不同激素配比對紫薯莖芽增殖繼代培養(yǎng)的影響

在紫薯外植體增殖繼代培養(yǎng)過程中，首先通過固定NAA濃度0.2 mg·L-1，添加不同濃度的6-BA(0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1)，形成E1、E2、E3、E4、E5等激素組合；再通過固定6-BA濃度3.0 mg·L-1，添加不同濃度的NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)，形成F1、F2、F3、F4、F5等組合，觀察不同激素配比的誘導結果(表2)。

表2 不同6-BA和NAA配比對紫薯繼代增殖的影響

結果表明，在不加6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，腋芽能夠萌發(fā)生長，但是增殖倍數比添加6-BA的各處理組都低，且萌發(fā)芽長勢明顯較差，這說明細胞分裂素6-BA對紫薯莖芽增殖繼代培養(yǎng)起重要作用。但當6-BA濃度為4 mg·L-1時，不僅腋芽增殖倍數下降，還會產生大量氣生根，降低了苗的質量。當6-BA濃度固定在3.0 mg·L-1，以NAA濃度為0.2 mg·L-1時，莖芽增殖倍數最高，7 d左右芽伸長0.5～1.0 cm，15 d左右便可以完全展開第一片葉，腋芽長勢旺盛，莖粗壯，葉片舒展，葉色深綠，有光澤(圖2B)。NAA濃度偏低或偏高均不利于莖芽增殖。因此，欣薯2號紫薯莖芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組合為：MS+6-BA3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

同時，實驗發(fā)現，當6-BA與NAA以不同濃度在培養(yǎng)基中一起使用時，欣薯2號紫薯增殖芽的誘導效果增強，增殖倍數最高可達5.96，此時6-BA濃度為3 mg·L-1，NAA為0.2 mg·L-1?？梢缘贸鲂朗?號紫薯莖尖的繼代增殖最佳培養(yǎng)基組合為：MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

2.3 不同激素配比和不同無機鹽離子濃度對紫薯莖芽生根的影響

將增殖培養(yǎng)所得的健壯莖芽，轉接到MS添加不同濃度NAA和IBA的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，30 d后，調查生根情況(表3)。結果表明：莖芽在不添加生長素的MS培養(yǎng)基上也能生根，生根率為32%；在添加不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基上，NAA為0.4 mg·L-1時生根率最高，且平均每株生根數也最高；在添加不同濃度IBA的MS培養(yǎng)基上，NAA為0.4 mg·L-1時生根率最高，但平均每株生根數以0.5 mg·L-1最高。因此，在MS培養(yǎng)基中，加入0.3～0.4 mg·L-1的NAA或0.3～0.5 mg·L-1的IBA均可促進紫薯莖芽生根。同時還發(fā)現，NAA對紫薯莖芽生根效果更好，苗的長勢更強壯(圖2C)，而IBA處理組的組培苗偏細長，長勢較弱。因此，NAA濃度為0.4 mg·L-1更有利于無菌芽的生根。

圖2 欣薯2號紫薯組培苗A.誘導的愈傷組織；B.增殖莖芽；C.生根的組培苗

表3 不同濃度的NAA和IBA對無菌苗生根的影響

實驗中，將增殖培養(yǎng)所得的健壯莖芽轉接到含有NAA 0.4 mg·L-1的三種基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察發(fā)現，在1/2MS培養(yǎng)基上生根率和平均每株生根數最高(表4)。這說明適當降低培養(yǎng)基中無機鹽離子濃度有利于生根。

表4 不同無機鹽離子濃度對紫薯莖芽生根的影響

3 討論

外植體的消毒方法一般采用1%HgCl2溶液浸泡，滅菌效果好，成活率高， NaClO處理紫薯莖段的成活率不高，滅菌效果不佳。由于紫薯是一種天然、健康的保健食品，1%HgCl2溶液容易產生重金屬離子殘留污染等問題，因此實驗中探索出欣薯2號外植體的消毒方案為：75%酒精處理30 s+2.5%NaClO溶液處理15 min+無菌水清洗3次。這樣得到的欣薯2號紫薯外植體成活率可達75%以上。

在紫薯外植體愈傷組織和莖芽誘導培養(yǎng)及莖芽增殖培養(yǎng)中，MS培養(yǎng)基中不同的植物生長調節(jié)劑的配比誘導莖尖分化成苗的是主要影響因素，紫薯莖尖的最佳誘導培養(yǎng)基組合是：MS+6-BA 0.75 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，紫薯莖芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組合為：MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1?？梢?，適度增加細胞分裂素濃度有利于莖芽分化增殖。

欣薯2號紫薯組培苗在不添加任何植物生長調節(jié)劑的1/2MS、MS和2MS培養(yǎng)基中，都可以生根，但是生根時間較久，根細長。在三種培養(yǎng)基中添加誘導生根的NAA和IBA，生根時間、根苗質量均有所改善。其中NAA對根的誘導效果較IBA好，根粗壯、苗的長勢也較好。濃度實驗表明，低濃度的生長素促進細胞伸長，促進生根，而高濃度的生長素抑制生長，甚至有可能導致植株死亡。紫薯無根組培苗最佳NAA生根濃度為0.4 mg·L-1。在添加NAA濃度為0.4 mg·L-1的1/2MS、MS和2MS三種培養(yǎng)基中，以1/2MS的效果最好，說明低濃度的無機鹽有利于生根，這與其他研究者的結果存在差異[2-5]。

欣薯2號紫薯在組織培養(yǎng)時也有出現褐化組培面莖細弱和玻璃化現象，褐化主要是因為外植體偏小造成的，外植體越小，其相對表面積越大，與空氣接觸的面積越大，組織中的酚類化合物越容易被氧化。玻璃化主要是因為組培苗在培養(yǎng)過程中光照不足或繼代培養(yǎng)次數過多造成的。

欣薯2號紫薯花青素含量高，產量高，可提取食用色素，加工提取淀粉，莖尖可做蔬菜，莖藤可做豬飼料等，開發(fā)利用前景廣闊。本研究初步探討了欣薯2號紫薯莖尖分化、增殖、生根的最適培養(yǎng)基，為該品種的快速繁殖奠定了技術基礎。楊強強等研究表明通過胚性愈傷和體細胞胚的誘導可進一步提高徐紫薯8號的繁殖系數[5]，這是否可用于欣薯2號紫薯還有待進一步研究。