游 莉 黃 薇 池祥波 陳耀凱 歐陽凈 王 麗 榮 黎

(西南大學(xué)醫(yī)院，重慶 400715)

作為發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，胃癌的藥物療效不容樂觀[1,2]。中藥在腫瘤防治中具有諸多優(yōu)勢。紅景天甙為紅景天提取物，在白血病、乳腺癌等腫瘤中功效顯著，極具開發(fā)前景，課題組前期功能實驗證明其能抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[3-5]。PI3K/AkT是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要通路，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，以關(guān)鍵分子為靶點的腫瘤藥物開發(fā)逐漸深入[6，7]。本研究以PI3K/AKT信號為靶點，研究其在紅景天甙促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用，為深入探究紅景天甙在胃癌中的治療效果及相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株AGS由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈。

1.1.2試劑 紅景天苷(南京格爾狄生物科技有限公司)，1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),胎牛血清(美國Gibco公司),IGF-1(美國Sigma Aldrich公司)，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)，Hoechst33342、AV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京碧云天生物公司)，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗體(上海abwaystechnology公司)

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。不含紅景天甙的1640培養(yǎng)基作為對照組，紅景天甙處理的胃癌細(xì)胞作為實驗組，10 μmol/L IGF-1預(yù)處理30 min的實驗組作為干預(yù)組。

1.2.2CCK-8法檢測紅景天甙對AGS細(xì)胞增殖的影響 80%～90%生長密度且狀態(tài)良好的對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞以5×104個/孔接種于96孔板，加入經(jīng)PBS溶解的不同濃度的紅景天甙，每組設(shè) 3個復(fù)孔。37℃培養(yǎng)48 h，1 700 r/min離心，棄上清，加入10 μl CCK-8試劑避光孵育1 h，酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(490 nm 和630 nm)檢測 OD值，計算IC50并繪圖。抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組) ×100%。

1.2.3Hoechst33342染色觀察紅景天甙對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 1×105個/孔細(xì)胞接種于含有無菌玻片的24孔板培養(yǎng)24 h，不同濃度紅景天甙處理48 h，PBS洗3次，500 μl 4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗3次，PBS 1∶20稀釋DAPI，每孔200 μl 稀釋液常溫染色10 min，PBS洗3次，封片，正置熒光顯微鏡觀察。

1.2.4AV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測紅景天甙對AGS細(xì)胞凋亡的影響 1×106個/孔接種于6孔板培養(yǎng)24 h，加入10 μmol/L IGF-1及不同濃度紅景天甙處理。48 h后收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌，懸浮于緩沖液中，AV/PI室溫暗處染色15 min。流式細(xì)胞儀分析樣品。

1.2.5免疫印跡觀察紅景天甙對凋亡蛋白及PI3K/AKT通路蛋白的影響 在積層膠聚合時收集處理好的AGS細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌1次，100 μl預(yù)冷Western細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞后冰浴裂解 30 min,4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清。BSA作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,Lowry法測定樣品蛋白濃度以確定上樣量。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入一抗和二抗,DAB顯色。室溫輕搖5 min 后觀察蛋白條帶,待顯色清晰轉(zhuǎn)入PBS漂洗,ECL化學(xué)發(fā)光照相。

2 結(jié)果

2.1紅景天甙抑制AGS細(xì)胞增殖 隨紅景天甙濃度增加，人胃癌AGS細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制(圖1)，且呈濃度依賴性，IC50值為36.54 μmol/L，40 μmol/L作用48 h后抑制為45.27%，最接近IC50，故以40 μmol/L作用48 h進(jìn)行相關(guān)檢測。

2.2紅景天甙促進(jìn)AGS細(xì)胞核固縮 Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，紅景天甙處理細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)固縮增加，表明紅景天甙促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖2)。

2.3紅景天甙促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞分析結(jié)果表明與對照組相比，紅景天甙處理組細(xì)胞凋亡率顯著增加(圖3)，PI3K/AKT激動劑IGF-1處理后，紅景天甙的促凋亡效應(yīng)受到明顯抑制(圖4)，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，凋亡率下降，表明紅景天甙可通過抑制PI3K/AKT通路促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡。

2.4免疫印跡檢測紅景天甙對凋亡蛋白及PI3K/AKT蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，紅景天甙抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，明顯促進(jìn)促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9和cleaved-PARP表達(dá)(圖5)。

圖1 CCK8法檢測紅景天甙對胃癌細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of salidroside on proliferation of gastric cancer cells by CCK8 assay

圖2 Hoechst染色觀察紅景天甙對AGS細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)影響Fig.2 Effects of salidroside on apoptotic morphology of AGS cells with Hoechst staining

圖3 流式細(xì)胞檢測紅景天甙對胃癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Flow cytometry was used to detect effects of salidroside on apoptosis of gastric cancer cells

圖4 流式細(xì)胞檢測IGF-1干預(yù)處理對紅景天甙促凋亡作用的影響Fig.4 Flow cytometry was used to detect effect of IGF-1 on salidroside-induced apoptosis

圖5 Western blot檢測紅景天甙對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of salidroside on apoptosis-related proteins was detected by Western blot

紅景天甙顯著抑制PI3K和AKT活化，磷酸化PI3K蛋白和磷酸化AKT蛋白表達(dá)下調(diào)(圖6)。PI3K/AKT激動劑IGF-1干預(yù)后，紅景天甙促凋亡效應(yīng)明顯減弱(圖7)。

圖6 Western blot檢測紅景天甙對PI3K/AKT通路蛋白的影響Fig.6 Influence of salidroside on PI3K/AKT pathway proteins was detected by Western blot

圖7 Western blot檢測IGF-1干預(yù)對紅景天甙促凋亡作用的影響Fig.7 Western blot was used to detect effect of IGF-1 on salidroside-induced apoptosis

3 討論

胃癌全球年發(fā)病率位居惡性腫瘤第四，年病死率位居第二，高居我國消化道腫瘤發(fā)病率首位[1,2]。胃癌早期癥狀隱匿，確診時多為進(jìn)展期，僅靠手術(shù)聯(lián)合放化療通常難以治愈，盡管內(nèi)鏡下早癌篩查近年已廣泛開展，但限于國民經(jīng)濟(jì)、文化、健康意識等因素，現(xiàn)階段早癌篩查仍未普及，以VEGF、EGF為主要靶點的分子靶向治療有待臨床驗證，目前胃癌的治療尤其是藥物治療效果不容樂觀[8,9]。紅景天甙(salidroside)是一種天然化合藥物，在乳腺癌、膀胱癌和結(jié)腸癌中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[10-14]。研究表明，紅景天甙通過氧化應(yīng)激和MAPK通路抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和遷徙，誘導(dǎo)凋亡，可抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長，并通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)自噬和凋亡[15,16]。對多株膀胱癌細(xì)胞的研究表明，紅景天甙通過抑制mTOR通路并誘導(dǎo)自噬進(jìn)而抑制細(xì)胞生長[17]。但紅景天甙在胃癌中的治療作用鮮有報道[18]。因此本課題組將紅景天甙應(yīng)用于胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紅景天甙對不同分化程度的胃癌細(xì)胞均具有抑制增殖和遷徙、促進(jìn)凋亡等作用[5]。

PI3K/AKT是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要信號通路，通過多種途徑影響下游效應(yīng)分子活化，發(fā)揮抑制凋亡和促進(jìn)增殖的作用,與人類諸多腫瘤密切相關(guān)[6，7]。研究證實PI3K調(diào)控激活A(yù)KT，直接抑制Bad、Caspase-9、GSK-3等活性，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生[19]。以PI3K/AKT通路中的關(guān)鍵分子為治療靶點的腫瘤藥物開發(fā)正逐步深入。

本研究聚焦于PI3K/AKT通路，探討紅景天甙促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)作用機(jī)制。通過Hoechst染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot從多角度提示紅景天甙顯著誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞凋亡，表明誘導(dǎo)凋亡是紅景天甙抑制胃癌細(xì)胞生長的重要方式。免疫印跡發(fā)現(xiàn)紅景天甙抑制磷酸化PI3K和磷酸化AKT蛋白的表達(dá)，提示紅景天甙抑制PI3K/AKT通路。進(jìn)一步利用PI3K/AKT激動劑IGF-1預(yù)處理AGS細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞和Western blot分析發(fā)現(xiàn)激活PI3K/AKT通路后，紅景天甙誘導(dǎo)凋亡的作用明顯減弱，揭示紅景天甙可通過抑制PI3K/AKT通路促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞凋亡。

綜上所述，紅景天甙作為植物類中藥在腫瘤防治中具有諸多優(yōu)勢，未來我們將進(jìn)一步利用細(xì)胞、動物模型結(jié)合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)等手段對紅景天甙的抗癌作用進(jìn)行深入研究，為闡明中藥紅景天甙防治腫瘤的機(jī)制提供依據(jù)。