張驚宇 鄭永慧 初婷婷

(黑龍江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,哈爾濱 150081)

近期有研究發(fā)現(xiàn)CDKL5敲除鼠的運動協(xié)調(diào)性差、少動、視力差，驚厥處理時腦電圖異常，視覺誘發(fā)反應(yīng)下調(diào)，這與雷特綜合征和自閉癥的表型相似[1]。敲除鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖更快，新生顆粒神經(jīng)元凋亡水平更高，導(dǎo)致分化的成熟神經(jīng)元減少，樹突嚴(yán)重萎縮，皮層更薄[2]。敲除CDKL5雖然抑制神經(jīng)元的分化，卻不影響膠質(zhì)細(xì)胞的分化[3]。敲除鼠腦中Akt、AMPK、PKC和MAKP信號通路受到影響，其中主要抑制Akt及下游mTOR、RSK和GSK-3β的磷酸化。抑制GSK-3β的活性可改善CDKL5敲除的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的缺陷[4]。此外，在成纖維細(xì)胞中，CDKL5通過調(diào)控剪切調(diào)控蛋白的磷酸化狀態(tài)來控制核小斑的形態(tài)，核小斑能持續(xù)為活性轉(zhuǎn)錄位點提供剪切因子，且確定CDKL5影響選擇性剪切[5]。CDKL5還調(diào)控基因表達(dá)。在CDKL5突變的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞中，GluD1(glutamate D1 receptor)的表達(dá)下調(diào)。GluD1能誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元的抑制性突觸前分化，與神經(jīng)疾病有關(guān)。 CDKL5的表達(dá)受到表觀遺傳學(xué)調(diào)控。神經(jīng)系統(tǒng)中(腦紋狀體和前扣帶皮層、PC12細(xì)胞)MeCP2和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶都抑制CDKL5的表達(dá)[6,7]，而MeCP2和Dnmt1正是CDKL5的激酶底物[8]。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國corning公司；所有培養(yǎng)基及添加劑均購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；載體pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA購自紐恩生物科技公司；CDKL5(ab22453)購自Abcam公司；GAPDH購自Sigma-Aldrich公司；Dnmt1購自Cayman公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87添加1%非必需氨基酸和1%(1 mmol/L)丙酮酸鈉；所有細(xì)胞均置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度5%。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建CDKL5 shRNA所用的載體為pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA。實驗涉及的shRNA序列為shCDKL5 R：5′-CCGGAGTGAGAGCTAAAG-GCATTTTCAAG-3′,F:5′-AGAAATGCCTTTAGCTCTCACTTTTTTTG-3′。干擾質(zhì)粒和融合質(zhì)粒委托紐恩生物技術(shù)公司包裝制成慢病毒顆粒濃縮液。

1.2.3mRNA提取和qPCR檢測 RNAiso試劑裂解U87細(xì)胞,氯仿抽提總RNA溶于無酶水(無DNA酶、無RNA酶)中,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR。檢測的MeCP2，Dnmt1，GAPDH q-PCR引物序列來源于NCBI。

1.2.4蛋白免疫印跡 分別提取細(xì)胞蛋白和組織蛋白，BCA定量后進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測，上樣量為(45 μg/孔)。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上(200 mA電流,室溫轉(zhuǎn)膜2 h),用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h,將稀釋后的一抗稀釋液敷于膜上,4℃過夜。清洗一抗后,1∶1 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗,室溫孵育1 h,清洗二抗后,用ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行顯色。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，t檢驗分析組間差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CDKL5在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87中的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，CDKL5在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87中高表達(dá)，通過shRNA敲減CDKL5后，其表達(dá)量顯著降低，表明敲減是有效的，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)(圖1)。

2.2敲減CDKL5引起表觀遺傳標(biāo)記物表達(dá)的改變 由于組蛋白修飾所調(diào)控的表觀遺傳學(xué)對于神經(jīng)干細(xì)胞的分化具有重要作用，本研究檢測了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中組蛋白H3的修飾情況。結(jié)果顯示，敲減CDKL5引起mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)水平上的表觀遺傳因子Dnmt1的下調(diào)和MeCP2的上調(diào)。以上結(jié)果表明，CDKL5有助于維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)特征。

圖1 CDKL5在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87中的表達(dá)Fig.1 CDKL5 protein expression in U87 cell lines

圖2 敲減CDKL5引起表觀遺傳標(biāo)記物表達(dá)的改變Fig.2 Knockdown of CDKL5 induces expression changes of epigenetic markersNote:A.mRNA level,***.P<0.001;B.Protein expression level.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，敲減膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的CDKL5改變多個表觀遺傳標(biāo)志，包括組蛋白H3的賴氨酸修飾和Dnmt1、MeCP2的表達(dá)。異常的組蛋白賴氨酸甲基化與腫瘤的關(guān)系已很明確[9]。抑制IDH1突變體、Dnmt1、KDM1等表觀遺傳相關(guān)蛋白來回調(diào)異常的組蛋白賴氨酸甲基化和乙?；艹晒φT導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化并抑制其生長[10-12]。在所有的組蛋白H3賴氨酸修飾中，H3K4me1/2/3、H3K9me1和H3K9ac與基因表達(dá)激活有關(guān)，而H3K9me2/3與基因沉默有關(guān)，因此，敲減CDKL5引起的H3K4me2、H3K9ac上調(diào)和H3K9me3下調(diào)或能重新激活抑癌基因的表達(dá)，同時沉默癌基因，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤分化，從而降低膠質(zhì)瘤的惡性程度[13]。

Dnmt1和 MeCP2都是CDKL5的激酶底物。其中Dnmt1是維持CpG島甲基化和組蛋白H3修飾模式的關(guān)鍵酶，參與有絲分裂、耐藥、自我更新等多種腫瘤相關(guān)事件[14]。Dnmt1能調(diào)控基因表達(dá)，而Dnmt1的表達(dá)也受到啟動子甲基化和賴氨酸甲基化依賴性蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控。CDKL5直接調(diào)控膠質(zhì)瘤中表觀遺傳修飾的機制尚不清楚，我們推測可能部分與Dnmt1有關(guān)。CDKL5促進(jìn)Dnmt1 N端(1-290aa)的磷酸化，但具體的磷酸化位點未知。此序列范圍內(nèi)有三個重要的絲氨酸磷酸化位點，其中Akt磷酸化S127和S143位點，PKC磷酸化S127位點，CDK1/2/5磷酸化S154位。這幾個位點所在的小段區(qū)域與Dnmt1的活性有關(guān)，其中S127位磷酸化避免Dnmt1/PCNA/UHRF1復(fù)合物的形成，降低Dnmt1的甲基轉(zhuǎn)移酶活性和DNA整體甲基化，促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展；S154位磷酸化主要促進(jìn)Dnmt1的活性[15]，S143位磷酸化抑制相鄰K142位的SET7依賴性單甲基化，從而免受泛素-蛋白酶體降解。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在CDKL5與Dnmt1的相互作用，理應(yīng)存在Dnmt1的磷酸化修飾。敲減CDKL5也下調(diào)Dnmt1的mRNA水平，故其蛋白水平的下調(diào)應(yīng)非S143磷酸化下調(diào)引起的蛋白降解所致。CDKL5無法調(diào)控Dnmt1的轉(zhuǎn)錄，其mRNA水平下調(diào)更可能歸因于整體表觀遺傳變化連帶引起的Dnmt1啟動子甲基化上調(diào)、對應(yīng)組蛋白修飾變化或?qū)?yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，而整體表觀遺傳變化是否由Dnmt1推動尚不知曉，需要深入研究。MeCP2通過結(jié)合甲基化的CpG島來抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，MeCP2參與神經(jīng)分化，而維甲酸不僅能上調(diào)MeCP2的表達(dá)，也能誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤C6細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，表明MeCP2與膠質(zhì)瘤分化有潛在聯(lián)系。敲減CDKL5引起Dnmt1的下調(diào)和MeCP2的上調(diào)結(jié)果表明，CDKL5可能參與維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)特征，為未來的研究提供了實驗基礎(chǔ)。