張玉蓉 賈俊枝 徐國(guó)明 郭 紅

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院日間病房，呼和浩特 010050)

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年約有63萬(wàn)新肝癌病例產(chǎn)生[1]。在我國(guó)，肝癌患者約占總癌癥病例的50%，其五年存活率約為5%[2]。現(xiàn)階段，對(duì)肝癌患者多采用手術(shù)切除及放、化療進(jìn)行治療，但多因再度復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移而預(yù)后不良[3]。近年來(lái)肝癌發(fā)病率逐年遞增，探究肝癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)[4]。miR-127-3p是一類抑癌基因，研究表明，在骨肉瘤中，miR-127-3p可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[5]；在骨巨細(xì)胞瘤中，miR-127-3p可顯著抑制癌細(xì)胞集落形成及瘤體形成[6]。而目前在肝癌中還沒(méi)有關(guān)于miR-127-3p作用機(jī)制的報(bào)道。本研究通過(guò)上調(diào)miR-127-3p，對(duì)其在肝癌細(xì)胞HepG2中的作用及機(jī)制進(jìn)行深入探索，為尋找肝癌的有效治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞HL-7702、肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠20只，鼠齡5～6周，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心[SYXK(蒙)2014-0003]，晝夜12 h交替，經(jīng)過(guò)滅菌處理的水和飼料自由攝取。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(IACUC 2014045)，實(shí)驗(yàn)操作遵循3R原則。

1.1.3主要試劑與儀器 DMEM高糖基本培養(yǎng)液(11965-092)、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司(3379)，胎牛血清FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(10100154)，青鏈霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(P1400)，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(15596026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4374967)、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(10928042)、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒(11668019)、熒光素酶檢測(cè)試劑盒(16177)、pcDNA 3.1載體(V79020)購(gòu)自美國(guó)Thermo fisher公司，RIPA裂解液(P0013E)、BCA試劑盒(P0012)、Hoechst染色試劑盒(C1017)、Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒(C1091)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，BrdU試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司(11647229001)，Ki67(sc-23900)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因Bcl-2(sc-509)、Bcl伴隨蛋白Bax(sc-20067)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF(sc-365578)、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9(sc-21733)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，絲裂原活化蛋白激酶MAPK4(ab211501)、cleaved Caspase-3(ab2302)、MAPK活化蛋白激酶MAPKAPK5(ab97332)、磷酸化MAPKAPK5(p-MAPKAPK5)(ab138668)、熱休克蛋白HSPB1(ab5579)、p-HSPB1(ab5594)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(BM1623)抗體及對(duì)應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)博士德生物工程有限公司，ABI7700 PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，pGL3 luciferase promoter載體(E1751)、GLO-Max20/20熒光檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)promega公司，熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人正常肝細(xì)胞HL-7702及肝癌細(xì)胞HepG2(ATCC)以體積分?jǐn)?shù)為15%的FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2，傳代次日換液，融合率達(dá)到85%以上后再以1×104個(gè)/ml 的濃度傳代。肝癌細(xì)胞HepG2分為control、miR-127-3p mimic、pcDNA 3.1-MAPK4(pc-MAPK4)及miR-127-3p mimic+pc-MAPK4(mimic+pc-MAPK4)組， miR-127-3p mimic及pc-MAPK4分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h，control組加入等量空載，轉(zhuǎn)染后換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2建立HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型 裸鼠分為control及miR-127-3p mimic組，每組10只。每只裸鼠皮下接種0.2 ml濃度為1×106個(gè)/ml的經(jīng)或未經(jīng)miR-127-3p轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞。飼養(yǎng)30 d，每隔5 d記錄腫瘤體積V=π/6(腫瘤長(zhǎng)徑/2+腫瘤短徑/2)3，然后斷頸處死，收集腫瘤組織并進(jìn)行石蠟包埋，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)miR-127-3p及MAPK4基因表達(dá) 將HL-7702、HepG2細(xì)胞及1.1.3中移植瘤組織進(jìn)行總RNA提取。細(xì)胞及移植瘤組織中加入Trizol于通風(fēng)櫥中裂解，依據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提，得到的總RNA進(jìn)行定量分析，取等量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒配制PCR體系并擴(kuò)增，得到閾值Δct，以對(duì)照組2-Δct平均值為基準(zhǔn)1，實(shí)驗(yàn)組2-Δct平均值與對(duì)照組2-Δct平均值相比得到的2-ΔΔct為相對(duì)變化倍數(shù)。

1.2.4熒光素酶實(shí)驗(yàn) 生物信息預(yù)測(cè)miR-127-3p與MAPK4間連續(xù)結(jié)合片段，PCR擴(kuò)增將片段插入熒光素酶報(bào)告載體中，構(gòu)建MAPK4 wt質(zhì)粒。對(duì)兩者間結(jié)合片段位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建MAPK4 mut質(zhì)粒。將miR-127-3p mimic與MAPK4 wt或mut共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.5BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖1.2.1中分組細(xì)胞以1.5×105個(gè)/ml的濃度接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，然后加入10 μmol/L BrdU孵育8 h，PBS洗滌。以含體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、5%冰乙酸的固定液冰上固定細(xì)胞，洗滌后加入BrdU單抗孵育4℃過(guò)夜，二抗室溫避光1 h。再用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.6Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 固定1.2.1中分組細(xì)胞，洗滌后利用Hoechst染色試劑盒進(jìn)行染色，操作方法依據(jù)Hoechst染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm，可檢測(cè)到細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.7Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 4℃預(yù)先融化Matrigel，取少量Matrigel到Transwell小室中預(yù)包被。接種1.2.1中分組細(xì)胞于上室，無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，棉簽拭去濾膜上層未遷移細(xì)胞，HE染色液對(duì)遷移下層細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 先在空白細(xì)胞培養(yǎng)板背面畫(huà)5～6條穿過(guò)板孔且相隔0.5～1 cm的橫線，然后在板中培養(yǎng)1.2.1中分組細(xì)胞。細(xì)胞鋪滿板孔時(shí)進(jìn)行劃痕，PBS洗滌后用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。于0和24 h進(jìn)行拍照并計(jì)算劃痕閉合率，劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.9Tunel檢測(cè)組織凋亡水平 石蠟切片脫蠟，滴加蛋白酶K修復(fù)，放入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液封閉5 min，滴加Tunel檢測(cè)液，37℃避光孵育1 h，洗滌后滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。凋亡細(xì)胞呈棕色，正常細(xì)胞為藍(lán)色。

1.2.10免疫組化檢測(cè)Ki67 石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)，滴加一抗至切片4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃ 1 h，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶蛋白親和素37℃作用40 min，洗滌后避光顯色并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核?？乖鞍钻?yáng)性細(xì)胞為棕色，正常細(xì)胞為藍(lán)色。

1.2.11蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取1.2.1中分組細(xì)胞及1.2.2中移植瘤組織總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量并調(diào)平，取蛋白30 μg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE將其分離，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉2 h室溫封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃ 1 h，最后曝光顯色，GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1miR-127-3p與MAPK4在肝癌HepG2細(xì)胞中存在靶向關(guān)系 生物信息預(yù)測(cè)has-miR-127-3p與MAPK4之間存在連續(xù)結(jié)合片段(圖1A)；與人正常肝細(xì)胞HL-7702比較，肝癌HepG2細(xì)胞中miR-127-3p表達(dá)降低(t=2.661,P=0.007 4)，MAPK4表達(dá)升高(t=7.156,P=0.003 1)，其中miR-127-3p相對(duì)表達(dá)水平為0.37±0.04，MAPK4相對(duì)表達(dá)水平為2.36±0.27；miR-127-3p mimic可提高HepG2細(xì)胞中miR-127-3p表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)水平為50.68±12.00(t=9.940,P=0.001 9)，降低MAPK4蛋白水平，其相對(duì)蛋白水平為0.17±0.08(t=4.296，P=0.002 2，圖1B)。pc-MAPK4可提高M(jìn)APK4蛋白水平，其相對(duì)蛋白水平為2.24±0.38，并減弱miR-127-3p mimic對(duì)MAPK4抑制作用，其相對(duì)蛋白水平為1.16±0.13(t=6.587,P=0.005 5，圖1B)；熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-127-3p mimic可降低MAPK4 wt的熒光素酶活性(t=18.805,P<0.001，表1)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)存在結(jié)合位點(diǎn)核苷酸突變的MAPK4 mut，miR-127-3p mimic處理組和未經(jīng)miR-127-3p mimic處理組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2miR-127-3p靶向MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響 各組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為control組(40.2±4.6)%，miR-127-3p mimic組(9.7±1.2)%，pc-MAPK4組(74.6±8.9)%，mimic+pc-MAPK4組(24.5±4.1)%；各組凋亡細(xì)胞百分比分別為control組(6.8±0.9)%，miR-127-3p mimic組(28.3±2.9)%，pc-MAPK4組(2.3±0.5)%，mimic+pc-MAPK4組(11.3±1.4)%。與control組比較，miR-127-3p mimic組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著減少(P=0.004 2，圖2A)，凋亡細(xì)胞百分比增多(P=0.005 1，圖2B)，Ki67及Bcl-2蛋白水平降低，Bax及cleaved Caspase-3蛋白水平升高(P=0.006 7，圖2C，表2)；pc-MAPK4組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比增多(P=0.008 8，圖2A)，凋亡細(xì)胞百分比減少(P=0.003 9，圖2B)，Ki67及Bcl-2蛋白水平升高，Bax及cleaved Caspase-3蛋白水平降低(P=0.003 6，圖2C，表2)。與miR-127-3p mimic組比較，mimic+pc-MAPK4組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比增多(P=0.004 8，圖2A)，凋亡細(xì)胞百分比減少(P=0.006 3，圖2B)，Ki67及Bcl-2蛋白水平升高，Bax及cleaved Caspase-3蛋白水平降低(P=0.007 1，圖2C，表2)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GroupsControlmiR-127-3p mimicMAPK4 wt4.73±0.421.09±0.22MAPK4 mut4.79±0.434.67±0.48

2.3miR-127-3p靶向MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲遷移的影響 各組細(xì)胞劃痕愈合率分別為Control組(86.0±9.0)%，miR-127-3p mimic組(51.0±5.0)%，pc-MAPK4組(95.0±9.0)%，mimic+pc-MAPK4組(67.0±6.0)%；各組侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為control組188±15，miR-127-3p mimic組86±11，pc-MAPK4組274±27，mimic+pc-MAPK4組151±19。與control組比較，miR-127-3p mimic組中細(xì)胞劃痕閉合率降低(P=0.007 3，圖3A)，侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P=0.005 6，圖3B)，MMP-9及VEGF蛋白水平降低(圖3C，表3)；pc-MAPK4組中細(xì)胞劃痕閉合率升高(P=0.008 5，圖3A)，侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.01，

圖2 miR-127-3p mimic及pc-MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

Fig.2 Effect of miR-127-3p mimic and pc-MAPK4 on proliferation and apoptosis of HepG2

Note： A.Detection of cell proliferation by BrdU(×400);B.Detection of cell apoptosis by Hoeschst(×400);C.Detection of proliferation and apoptosis related protein levels by Western blot.1.Control;2.miR-127-3p mimic;3.pc-MAPK4;4.mimic+pc-MAPK4.

GroupsKi67Bcl-2Baxcleaved Caspase-3miR-127-3p0.21±0.040.29±0.043.45±0.263.46±0.25pc-MAPK42.38±0.222.46±0.240.33±0.040.35±0.04mimic+pc-MAPK40.88±0.080.91±0.091.69±0.141.71±0.13F394.023334.14496.00540.16P<0.001<0.001<0.001<0.001

圖3 miR-127-3p mimic及pc-MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲遷移的影響

Fig.3 Effect of miR-127-3p mimic and pc-MAPK4 on invasion and migration of HepG2

Note： A.Detection of cell invasion by Transwell;B.Detection of cell migration by wound healing;C.Detection of MMP-9 and VEGF protein levels by Western blot.1.Control;2.miR-127-3p mimic;3.pc-MAPK4;4.mimic+pc-MAPK4.

GroupsMMP-9VEGFmiR-127-3p mimic0.19±0.040.18±0.04pc-MAPK42.08±0.301.97±0.23mimic+pc-MAPK40.76±0.070.72±0.08F175.32249.17P<0.001<0.001

圖4 miR-127-3p mimic及pc-MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞中MAPK4下游蛋白的影響Fig.4 Effect of miR-127-3p mimic and pc-MAPK4 on downstream protein of MAPK4 in HepG2Note:n=6；1.Control;2.miR-127-3p mimic;3.pc-MAPK4;4.mimic+pc-MAPK4.

表4 MAPK4下游蛋白水平

Tab.4 Downstream protein levels of MAPK4

Groupsp-MAPKAPK5/MAPKAPK5p-HSPB1/HSPB1miR-127-3p mimic0.32±0.060.28±0.04pc-MAPK42.13±0.201.88±0.18mimic+pc-MAPK40.74±0.090.71±0.08F312.45305.48P<0.001<0.001

圖5 miR-127-3p mimic對(duì)HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的影響Fig.5 Effect of miR-127-3p mimic on subcutaneous transplantation of HepG2 cells in nude miceNote:A.Volumetric growth curve of subcutaneous xenografts in nude mice;B.Appearance of subcutaneous xenograft tumors in nude mice;C.Percentage of Ki67 positive cells detected by immunohistochemistry;D.Tunel detection of tumor cell apoptosis;E.Western blot detection MMP-9 protein level and p-MAPKAPK5/MAPKAPK5 ratio.

圖3B)，MMP-9及VEGF蛋白水平升高(P=0.005 8，圖3C，表3)。與miR-127-3p mimic組比較，mimic+pc-MAPK4組中細(xì)胞劃痕閉合率升高(P=0.008 3，圖3A)，侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P=0.007 8，圖3B)，MMP-9及VEGF蛋白水平升高(P=0.006 8，圖3C，表3)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4miR-127-3p靶向MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞中MAPK4下游蛋白的影響 與control組比較，miR-127-3p mimic組中p-MAPKAPK5/MAPKAPK5及p-HSPB1/HSPB1降低(P=0.007 5)，pc-MAPK4組中p-MAPKAPK5/MAPKAPK5及p-HSPB1/HSPB1升高(P=0.006 8，圖4，表4)。與miR-127-3p mimic組比較，mimic+pc-MAPK4組中p-MAPKAPK5/MAPKA PK5及p-HSPB1/HSPB1升高(P=0.005 5，P=0.005 6，圖4，表4)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5miR-127-3p靶向MAPK4對(duì)HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的影響 與control組比較，miR-127-3p mimic組HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤體積降低，其中control組終體積(2 035±156)mm3，miR-127-3p mimic組終體積(1 089±123)mm3(P=0.007 3，圖5A、B)；同時(shí)control組瘤重(2.42±0.20)g，miR-127-3p mimic組瘤重(1.34±0.16)g (P=0.005 5)；miR-127-3p表達(dá)升高，MAPK4表達(dá)降低，其中miR-127-3p相對(duì)表達(dá)水平34.85±7.40，MAPK4相對(duì)表達(dá)水平0.38±0.05(P<0.001)；Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分比減少，其中control組陽(yáng)性細(xì)胞百分比(43.0±5.0)%，miR-127-3p mimic組陽(yáng)性細(xì)胞百分比(9.0±2.0)%(P=0.004 7，圖5C)，凋亡細(xì)胞百分比增多，其中control組凋亡百分比(7.0±2.0)%，miR-127-3p mimic組凋亡百分比(49.0±6.0)%(P=0.004 2，圖5D)；MMP-9蛋白水平與p-MAPKAPK5/MAPKAPK5降低，其中MMP-9蛋白水平0.21±0.10，p-MAPKAPK5/MAPKAPK5比值0.22±0.09(P=0.004 7，P=0.003 5，圖5E)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

近十年來(lái)，miRs逐漸被報(bào)道參與了各種生物過(guò)程，包括細(xì)胞存活、增殖、分化、凋亡及運(yùn)動(dòng)[7]。同時(shí)，某些miRs還可通過(guò)負(fù)調(diào)控原癌基因作為癌癥的抑制因子[8]， miR-127-3p也是一種腫瘤抑制因子，大量研究報(bào)道了miR-127-3p的腫瘤抑制作用[5,6,9]。本文通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-127-3p與MAPK4存在連續(xù)結(jié)合片段，預(yù)示miR-127-3p與MAPK4間存在靶向關(guān)系。MAPK4是MAPK信號(hào)通路中的重要一員，其表達(dá)上調(diào)可顯著提高細(xì)胞的增殖能力[10]。本文通過(guò)對(duì)比正常肝細(xì)胞HL-7702發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞HepG2中miR-127-3p基因表達(dá)顯著降低，MAPK4蛋白水平顯著升高，提示miR-127-3p下調(diào)及MAPK4上調(diào)與肝癌發(fā)生有關(guān)；利用miR-127-3p mimic上調(diào)miR-127-3p后，MAPK4蛋白水平顯著下降，提示miR-127-3p對(duì)MAPK4有潛在調(diào)控作用；同時(shí)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-127-3p mimic可顯著降低MAPK4 wt熒光素酶活性，而對(duì)MAPK4 mut沒(méi)有顯著影響。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在HepG2細(xì)胞中，miR-127-3p可靶向下調(diào)MAPK4表達(dá)。

降低癌細(xì)胞增殖能力可有效阻止癌癥發(fā)生及其進(jìn)一步惡化。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-127-3p不僅可降低癌細(xì)胞增殖能力，還可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，如miR-127-3p可通過(guò)負(fù)調(diào)控其靶基因細(xì)胞色素C氧化酶同源組裝因子COA1顯著降低骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力并阻止瘤體形成[6]；通過(guò)負(fù)調(diào)控賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SETD8及整合素亞基-α 6顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并提高Caspase-3活性[5,11]。Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序的關(guān)鍵蛋白，其活性增強(qiáng)預(yù)示著凋亡水平的提高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞中，上調(diào)miR-127-3p后，可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4顯著減少BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比及Ki67、Bcl-2表達(dá)，增加凋亡細(xì)胞百分比及Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)，而過(guò)表達(dá)MAPK4可顯著增加BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比及Ki67、Bcl-2表達(dá)，減少凋亡細(xì)胞百分比及Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)，并減弱miR-127-3p產(chǎn)生的抑增殖促凋亡作用。Ki67是細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平可用于評(píng)估細(xì)胞的增殖能力[13]。Bcl-2是凋亡研究中最受重視的癌基因，可顯著抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]，而B(niǎo)ax是一類促凋亡蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體通透性及凋亡誘導(dǎo)因子活性提高細(xì)胞凋亡水平[15]。cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，可作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平的經(jīng)典指標(biāo)[16]。同時(shí)，在本文中，miR-127-3p可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4顯著減小HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤體積，減少組織中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分比并增加凋亡細(xì)胞百分比。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，miR-127-3p可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4顯著抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡的發(fā)生。

易復(fù)發(fā)易轉(zhuǎn)移是現(xiàn)階段肝癌治療后出現(xiàn)預(yù)后不良的主要原因，控制癌細(xì)胞侵襲及遷移可降低癌組織的轉(zhuǎn)移概率[3]。研究表明，miR-127具有強(qiáng)烈的抗侵襲遷移作用，可通過(guò)下調(diào)其靶基因的表達(dá)顯著抑制胰腺癌、骨肉瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌及骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲及遷移[17-20]，而miR-127表達(dá)下調(diào)對(duì)乳腺癌組織生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移有顯著促進(jìn)作用[21]。同時(shí)，作為miR-127的穩(wěn)定表型，報(bào)道表明miR-127-3p可通過(guò)靶向作用顯著降低骨肉瘤及骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力[5,6]。在本研究中，上調(diào)miR-127-3p不僅可減少HepG2侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕閉合率及MMP-9、VEGF表達(dá)，還可降低HepG2裸鼠皮下移植瘤組織中MMP-9蛋白水平。而過(guò)表達(dá)MAPK4可顯著提高HepG2細(xì)胞在體內(nèi)及體外的侵襲及遷移能力，并減弱miR-127-3p產(chǎn)生的抗侵襲遷移作用。MMP-9是金屬基質(zhì)蛋白酶家族的一員，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，其表達(dá)量增加能顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲遷移[22,23]。VEGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，參與癌組織新生血管和新生淋巴管的形成[24]。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，miR-127-3p可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4顯著抑制HepG2細(xì)胞侵襲遷移。絲裂原活化蛋白激酶MAPK4是MAPK-活化蛋白激酶MAPKAPK5的主要調(diào)節(jié)因子之一，MAPK4可直接激活MAPKAPK5，沉默MAPK4可導(dǎo)致MAPKAPK5活性發(fā)生顯著降低[25]。研究表明，MAPKAPK5在肝癌細(xì)胞中被顯著激活，并抑制cleaved Caspase-3及DNA修復(fù)酶PARP蛋白表達(dá)，從而顯著降低癌細(xì)胞凋亡水平并促進(jìn)細(xì)胞存活[26]。在本研究中，miR-127-3p可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4顯著降低其下游蛋白MAPKAPK5及HSPB1在HepG2細(xì)胞中的磷酸化比值。HSPB1是MAPKAPK5的直接作用底物，在體內(nèi)主要發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的功能，臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HSPB1磷酸化比值與肝癌患者腫瘤直徑及其門靜脈侵襲率呈正比[27]。提示HSPB1與癌癥發(fā)展有著密切聯(lián)系，miR-127-3p可能通過(guò)此通路對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，miR-127-3p可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2在體內(nèi)及體外增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)其凋亡的發(fā)生。同時(shí)，miR-127-3p還可通過(guò)靶向下調(diào)MAPK4抑制其下游蛋白MAPKAPK5及HSPB1磷酸化，提示miR-127-3p可能通過(guò)此通路阻礙HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，為miR-127-3p用于肝癌臨床治療提供理論依據(jù)。