孫朋浩，薛玉環(huán)，吳永繼，任 瑋，鄭 偉，朱曉巖，趙善廷,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

元寶楓為槭樹科槭屬植物，為中國特有樹種，其籽仁含油率可高達(dá)48%，最近研究發(fā)現(xiàn)元寶楓油中含有5%～6%的神經(jīng)酸[1-4]，元寶楓籽是一種營養(yǎng)豐富的天然食品，民間早有炒食元寶楓籽的習(xí)慣。2011年3月22日中華人民共和國衛(wèi)生部第9號文件批準(zhǔn)元寶楓籽油為新資源食品，自此元寶楓籽油正式進(jìn)入我國食用植物油行列。已有研究表明元寶楓籽油具有促進(jìn)大腦發(fā)育、修復(fù)受損神經(jīng)元、抑菌及抗腫瘤的作用[2-4]。

2000年，諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎獲得者Lederberg提出：人是由人體自身的真核細(xì)胞及與人共生的微生物細(xì)胞共同組成的“超級生物體”[5]。2016年Sender等重新估算了人體腸道細(xì)菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)其與人體細(xì)胞的數(shù)量比約為1.3∶1[6]。這些細(xì)菌編碼330多萬個基因，大約是人類基因組150 倍，可謂人類的“第二基因組”[7]。腸道菌群與宿主進(jìn)行著活躍的代謝交換和共代謝，參與機(jī)體的免疫調(diào)劑、神經(jīng)調(diào)節(jié)、物質(zhì)消化和吸收等諸多方面內(nèi)容[8-9]。腸-腦軸是腸和腦之間的信息交流系統(tǒng)途徑，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群能夠通過腦-腸軸影響腦的活動甚至宿主行為[8]。

將元寶楓籽作為食品，如何影響腸道菌群？腸道菌群在消化系統(tǒng)中扮演了重要的角色，宿主腸道菌群的建立起始于出生后，到了成年時(shí)期，腸道菌群已經(jīng)基本穩(wěn)定，對非內(nèi)源性的細(xì)菌具備了高度的抗定植能力[9-11]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成受到多種因素的影響：遺傳背景、生活環(huán)境、飲食等，其中飲食結(jié)構(gòu)對于菌群結(jié)構(gòu)變化的影響最為深刻[12-15]。飲食可通過多種機(jī)制影響腸道菌群的組成和活性，目前認(rèn)為，飲食可以給予某些特定的能利用其成分的細(xì)菌選擇性生長優(yōu)勢，從而成為改變腸道微生態(tài)的主要驅(qū)動力[12-15]。早期的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)元寶楓籽具有抑菌的作用[3]，本實(shí)驗(yàn)旨在探究元寶楓籽作為食品對宿主腸道菌群的調(diào)整作用以及對有害菌的抑制作用。

如何觀察腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)及其變化？微生物純培養(yǎng)技術(shù)是研究微生物學(xué)的經(jīng)典方法，然而，微生物的數(shù)量和多樣性巨大，至今僅有極小部分物種被成功分離培養(yǎng)[16]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和測序價(jià)格的下降，標(biāo)記基因分析方法已經(jīng)成為微生物組學(xué)分析的有力工具[17-19]。本實(shí)驗(yàn)通過Illumina HiSeq 2500測序系統(tǒng)對細(xì)菌16S RNA編碼區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增注釋，以評估元寶楓籽作為食品對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響以及對腸道內(nèi)有害菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8 周齡清潔級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量約28～30 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)，生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2002-005。

元寶楓籽購于遼寧彰武，炒制。

DNA提取試劑盒 上海MO BIO Laboratories公司；HiSeq Rapid SBS Kit v2測序試劑盒、文庫構(gòu)建TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Qubit 2.0實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國Thermo Fisher公司；HiSeq 2500系統(tǒng) 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組

將小鼠隨機(jī)分為對照組（C）和實(shí)驗(yàn)組（Y），每組各10 只。在實(shí)驗(yàn)組的日糧中每天加入1.5 g元寶楓籽，連續(xù)飼喂2 周，對照組正常飼喂。

1.3.2 小鼠糞便的采集

將小鼠置于干凈空曠的鼠籠中，待糞便排出后，迅速用無菌鑷子夾取糞便于無菌1.5 mL EP管中并置于冰盒中保存；同一批樣品采集完成后，統(tǒng)一將裝有糞便的EP管用液氮處理，暫時(shí)保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 糞便樣品預(yù)處理

稱取220 mg糞便于2 mL微量離心管中，加入1.4 mL裂解緩沖液，漩渦混勻，70 ℃孵育5 min，重復(fù)2 次。吸取1.2 mL上清液至2 mL微量離心管，加入1 片InhibitEX，立即漩渦1 min至InhibitEX片完全懸浮，室溫下孵育1 min，吸附破壞樣品中的DNA破壞物質(zhì)和PCR抑制劑，離心3 min，吸取所有上清液至1.5 mL離心管，再離心3 min。

1.3.4 DNA提取

根據(jù)試劑盒說明書，從預(yù)處理后的樣品中提取總細(xì)菌DNA。通過A260nm/A280nm和A260nm/A230nm的比率評估DNA質(zhì)量和數(shù)量，然后將DNA儲存在-80 ℃條件下，待進(jìn)一步處理。

1.3.5 16S rDNA測序分析

用通用引物（F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）結(jié)合適配序列和條形碼序列擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。最后用Quant-it?dsDNA-HS試劑對所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并匯集在一起。在HiSeq 2500平臺（2×250 對末端）上對純化的匯集樣本進(jìn)行高通量測序。

1.3.6 高通量測序數(shù)據(jù)分析

根據(jù)下機(jī)序列之間的重疊關(guān)系，將HiSeq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags，同時(shí)對序列的質(zhì)量和合并的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。使用QIIME 1.8.0[20]軟件中的UCLUST[21]算法對Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類并獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并基于Silva分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。后續(xù)結(jié)果分析依靠QIIME和R等軟件，對不同組間和組內(nèi)的樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及繪圖使用SPSS 25.0以及R 3.5.3軟件完成。采用方差分析法進(jìn)行組間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)過程中，每天記錄小鼠體質(zhì)量，將連續(xù)3 d的數(shù)據(jù)合并取平均值，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對照組的體質(zhì)量變化趨勢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠體質(zhì)量變化趨勢相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

將HiSeq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)使用FLASH 1.2.7軟件拼接成一條Tags后，對拼接后的Tags使用Trimmomatic 0.33軟件進(jìn)行過濾，去除過長和過短的序列，得到高質(zhì)量的Tags；使用UCHIME 4.2鑒定并去除嵌合體，最終得到有效數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)組和對照組中每個樣本測序后的有效序列數(shù)均在6×104條左右，表明本實(shí)驗(yàn)的測序質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的分析。

2.3 OTU分析結(jié)果

使用QIIME 1.8.0軟件中的UCLUST算法對預(yù)處理后的Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU。通過聚類后，實(shí)驗(yàn)組和對照組的樣品聚類后的平均OTU數(shù)目均在400以上，表明樣品序列的聚類結(jié)果比較可靠，可用于下一步樣品序列的注釋，并且再一次表明本次實(shí)驗(yàn)的測序質(zhì)量比較高。

2.4 Alpha多樣性變化分析結(jié)果

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組和對照組的ACE平均指數(shù)和Chao1平均指數(shù)相近，表明兩組內(nèi)腸道菌群的物種數(shù)量比較相近；相比于對照組，實(shí)驗(yàn)組的Simpson平均指數(shù)要高一些，而Simpson平均指數(shù)與Alpha多樣性成反比；兩組的Shannon平均指數(shù)相近。綜合這4 個指數(shù)可以發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組和對照組中腸道菌群的物種數(shù)量比較相近，實(shí)驗(yàn)組菌群組成的均勻度要低于對照組。但是對于這4 個指數(shù)，組間并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 Beta多樣性變化

圖2 小鼠腸道菌群組間多樣性比較Fig. 2 Comparison of the diversity of intestinal flora between groups

使用QIIME軟件進(jìn)行Beta多樣性分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。通過樣品相關(guān)性熱圖（圖2A）和UPGMA聚類樹（圖2B）對所有樣品進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)組內(nèi)個體聚類較為集中統(tǒng)一，而組間聚類分離比較明顯，表明在元寶楓籽的干預(yù)下，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較明顯的改變。

為了進(jìn)一步描述不同樣品的物種多樣性差異，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）（圖2C）。通過PCoA分析可知，實(shí)驗(yàn)組和對照組數(shù)據(jù)在第一解釋因素和第二解釋因素構(gòu)成的象限下發(fā)生明顯的分離（PERMANOVA：P＜0.041；R2＝0.0939 46），這表明實(shí)驗(yàn)組和對照組的腸道菌群的物種結(jié)構(gòu)組成存在顯著性差異。

考慮到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的高維情況，為了彌補(bǔ)PCoA的不足，進(jìn)行了偏最小二乘法（partial least squares regression，PLS-DA）分析（圖2D）。圖2D結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)和對照組數(shù)據(jù)依然可以發(fā)生很好的分離，因而認(rèn)為在元寶楓籽作為食物的影響下，實(shí)驗(yàn)組和對照組的腸道菌群的物種結(jié)構(gòu)組成存在顯著性差異。

2.6 菌群結(jié)構(gòu)分析

圖3 門分類學(xué)水平的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成Fig. 3 Bacterial community structure at phylum level

將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫（Silva數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行比對，進(jìn)行分類學(xué)注釋得到不同分類學(xué)水平的結(jié)果。圖3展示的是門分類學(xué)水平的分類結(jié)果，可以看出：無論是實(shí)驗(yàn)組還是對照組，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）均為其優(yōu)勢菌門；比較組間豐度變化發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，實(shí)驗(yàn)組中厚壁桿菌門相對豐度上升而擬桿菌門的相對豐度下降，比較厚壁桿菌門和擬桿菌門相對豐度比值（F/B）的變化，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組F/B平均值要高于對照組（P＝0.063）。

圖4是實(shí)驗(yàn)組和對照組中各個樣品屬水平的分類學(xué)結(jié)果，比較組間和組內(nèi)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：首先是組內(nèi)數(shù)據(jù)變異比較大，同一菌屬在不同樣本對象的表達(dá)豐度差異變化比較大，因此也難于直接比較組間的數(shù)據(jù)差異。對于不同組間菌屬的表達(dá)豐度差異，借助非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)以及機(jī)器學(xué)習(xí)等方法進(jìn)行分析，這一點(diǎn)在后面會詳述。但是可以看出：Lactobacillus、Lachnospiraccac NK4A136 group、Bacteroides、Prevotella-1以及Alloprevotella菌屬在對照組和實(shí)驗(yàn)組中均為優(yōu)勢菌屬。

圖4 屬分類學(xué)水平的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成Fig. 4 Bacterial community structure at genus level

2.7 組間差異物種鑒定

組間差異顯著性分析主要用于發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物對象。圖5A為線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析結(jié)果（本次實(shí)驗(yàn)分析的LAD值設(shè)為2.0）[22-23]。圖5B是隨機(jī)森林分類器篩選后門水平的評分結(jié)果，圖5C是隨機(jī)森林分類器篩選后屬分類水平的評分結(jié)果。將LEfSe和隨機(jī)森林的分析結(jié)果結(jié)合，篩選出重要性評分高且存在組間顯著性差異的對象，認(rèn)為這些是存在于組間有意義的差異物種（圖6、7）。

圖5 小鼠腸道菌群組間差異顯著性分析Fig. 5 Significance analysis of difference in intestinal flora between groups

圖6 小鼠腸道菌群組間門水平差異物種Fig. 6 Difference in intestinal flora between groups at phylum level

圖6 為門分類學(xué)水平的組間差異對象結(jié)果，分別為脫鐵桿菌門（Deferribacteres）和放線桿菌門（Actinobacteria）；其中，實(shí)驗(yàn)組中脫鐵桿菌門的平均豐度要高于對照組，而放線桿菌門的平均豐度要低于對照組。由于門分類學(xué)水平下包含許多菌屬，且不同菌屬對宿主的影響不盡相同，所以盡管發(fā)現(xiàn)了這兩個差異的門水平對象，卻難以直接描述這種差異變化對宿主的影響。但是這種差異現(xiàn)象是應(yīng)該被注意到的，因?yàn)樗碚鞯氖且环N趨勢性變化，而這種變化趨勢往往具有比較好的表現(xiàn)性和重復(fù)性，易于不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間進(jìn)行比較和解讀。

圖7 小鼠腸道菌群組間屬水平差異物種Fig. 7 Difference in intestinal flora between groups at genus level

圖7 為屬分類學(xué)水平組間差異種屬，實(shí)驗(yàn)組中Mucispirillum、Rikenella和Anaerotuncus的平均豐度要高于對照組，而Staphylococcus、Acinetobacter和Corynebacterium_1的平均豐度要低于對照組。Mucispirillum被報(bào)道作為結(jié)腸黏膜層的健康標(biāo)記物，它在病原微生物感染早期表現(xiàn)為豐度下降，在恢復(fù)期（病原體被清除之后）豐度回到正常水平；Staphylococcus和Acinetobacter均是被廣泛報(bào)道的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)易引起機(jī)體感染，是造成醫(yī)院內(nèi)感染的重要機(jī)會致病菌之一，在2017年世界衛(wèi)生組織公布的十二大耐藥性細(xì)菌中，Acinetobacter赫然排名在級別1——嚴(yán)重耐藥性的第一名。

2.8 共性網(wǎng)絡(luò)分析

共性網(wǎng)絡(luò)分析通過將不同屬性的對象抽象為節(jié)點(diǎn)，并用連接來展示不同節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系，通過量化以節(jié)點(diǎn)和連接為組件的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)指數(shù)，從而能夠在統(tǒng)一的框架下尋找復(fù)雜系統(tǒng)的共性。在紛雜的共性網(wǎng)絡(luò)里面，很難確定某幾個節(jié)點(diǎn)之間確切的關(guān)系，但是可以借助其尋找聯(lián)系緊密的特定群組或者反應(yīng)群體的結(jié)構(gòu)組成特征。

圖8 小鼠腸道菌群網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig. 8 Network analysis of intestinal flora in mice

由圖8可知，無論是對照組還是實(shí)驗(yàn)組，厚壁菌門和擬桿菌門構(gòu)成了主要的節(jié)點(diǎn)聚合中心，但是對照組中厚壁菌門和擬桿菌門的節(jié)點(diǎn)分布相對比較分散均一，而實(shí)驗(yàn)組中擬桿菌門和厚壁桿菌門呈現(xiàn)出兩極分離的趨勢，這提示實(shí)驗(yàn)組中門水平的物種結(jié)構(gòu)關(guān)系已經(jīng)發(fā)生了改變。

2.9 腸型的鑒定

按照屬水平聚類分析方法劃分腸型，根據(jù)腸型分類結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在對照組中20%的個體屬于1類腸型（ET B），80%的個體屬于3類腸型（ET F）；在實(shí)驗(yàn)組中，40%的個體屬于1類腸型（ET B），60%的個體屬于3類腸型（ET F）。

3 討 論

神經(jīng)酸在大腦和神經(jīng)組織中含量較高，常作為腦中白質(zhì)的標(biāo)志物，神經(jīng)酸因?yàn)槟軌蛐迯?fù)受損的神經(jīng)元并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生而備受關(guān)注[2-3]。神經(jīng)酸以往的來源主要依靠鯊魚，隨著國際社會禁捕鯊魚，各國政府和研究機(jī)構(gòu)開始把方向轉(zhuǎn)向從植物中提取神經(jīng)酸[24]。歐乞鍼從蒜頭果樹的種仁油中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)67%[25]。但因蒜頭果樹屬國家二級保護(hù)植物，其開發(fā)利用受到一定限制。王性炎教授等從槭樹喬木元寶楓的籽中也發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)酸，其在元寶楓油中的含量在5%～6%[26]。元寶楓是中國含神經(jīng)酸木本植物的一個特有樹種，目前仍是提取神經(jīng)酸的主體資源[27]。研究發(fā)現(xiàn)，元寶楓油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和黃曲霉菌具有明顯的抗菌作用[3]。

為了研究飲食對腸道菌群的影響，可以通過長期飲食習(xí)慣或飲食干預(yù)方法分別了解其長期及短期影響[28-32]。飲食作為腸道菌群的一種生態(tài)驅(qū)動力，使腸道菌群能適應(yīng)其暴露的飲食結(jié)構(gòu)，有研究發(fā)現(xiàn)：腸道菌群能夠反映宿主的飲食習(xí)慣、腸道結(jié)構(gòu)和生理狀況[13-14]。本實(shí)驗(yàn)將元寶楓籽作為食物飼喂小鼠，飼喂2 周后，檢測小鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)高通量測序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組之間Beta多樣性發(fā)生了顯著性的差異，這表明在通過元寶楓籽進(jìn)行飲食干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組的腸道菌群組成發(fā)生了顯著性的改變，那么如何去評價(jià)這種改變呢？從兩個方面去嘗試分析：物種分類學(xué)上的差異改變，即腸道菌群的物種結(jié)構(gòu)組成；腸道菌群功能組成上的變化。

首先進(jìn)行LEfSe分析，LEfSe分析是基于非參數(shù)檢驗(yàn)方法確定不同組間的差異對象，然后進(jìn)行對象的亞類判定，建立線性判別分析模型，最終得到特定分類水平下的差異物種列表及差異對象的效應(yīng)值。這種方法是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差異來篩選對象的，那是否統(tǒng)計(jì)學(xué)差異就等同于生物學(xué)意義上的差異？為此引入了隨機(jī)森林分類器，隨機(jī)森林是基于決策樹的集成學(xué)習(xí)算法，通過對每個基本分類器的分類結(jié)果進(jìn)行組合，來決定待分類樣本的歸屬類別[33]。通過對每一分類學(xué)水平內(nèi)包含的對象進(jìn)行重要性評分，按照從高到低排序，決定哪些對象是重要的，值得注意的是：這里的重要性不等同于統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著性。通過結(jié)合這兩種分析篩選方法，在門水平和屬水平分別找出了組間差異的物種，在屬分類學(xué)水平的對象中，實(shí)驗(yàn)組中Mucispirillu的平均豐度要高于對照組。正如結(jié)果分析部分中提到的，Mucispirillum是一種已經(jīng)被報(bào)道的宿主健康狀態(tài)下的標(biāo)志菌屬，其豐度變化常與腸道炎癥的發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。Mucispirillum常在結(jié)腸遠(yuǎn)端的外層腸黏膜表面形成集群，在病原菌屬進(jìn)攻損傷腸黏膜的時(shí)候，Mucispirillum的豐度往往會下降；黏膜層完整的恢復(fù)開始于病原體清除后一段時(shí)間內(nèi)，于此同時(shí)，Mucispirillum的豐度也會逐漸恢復(fù)到健康水平，因此，Mucispirillum能作為遠(yuǎn)端結(jié)腸表層黏膜層健康水平的標(biāo)記物，用于表征潛在的炎性結(jié)腸炎；其他細(xì)菌類型標(biāo)志物，如梭菌屬和乳桿菌屬，在病原體消失后這些標(biāo)志物豐度也會增加。于此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中Staphylococcus和Acinetobacter的平均豐度要低于對照組，這兩種菌屬是已經(jīng)被廣泛報(bào)道的機(jī)會性致病菌，Acinetobacter更是公認(rèn)的嚴(yán)重耐藥菌屬。盡管這兩種菌屬在正常宿主機(jī)體內(nèi)不發(fā)病，但是當(dāng)宿主免疫水平降低或者遭受其他病理性因素影響時(shí)，這些菌屬往往會成為繼發(fā)感染的菌屬[34-35]。

腸道菌群行使多種代謝分解功能，每個功能的實(shí)現(xiàn)往往是多種細(xì)菌相互協(xié)同拮抗來實(shí)現(xiàn)的，因此，在考慮不同分類學(xué)水平上單個差異物種的同時(shí)，更應(yīng)該去分析不同因素干預(yù)下菌群功能組成上的變化[36]。群體分型是一種有助于更好地理解人類身心健康等復(fù)雜生物學(xué)問題的有效方法，將這種方法應(yīng)用于腸道微生物中，可以將不同的群落組成定義為腸型，腸型的意義在哪里呢？個體間微生物群落存在著巨大的差異，同時(shí)微生物群落變化還表現(xiàn)出不同的階段性，目前，在大群體和跨地理研究中，還很難簡單地描述如此復(fù)雜的生物現(xiàn)象，部分原因是有些菌屬在不同個體間表現(xiàn)為單峰，而另外一些菌屬又表現(xiàn)出雙峰或者更復(fù)雜的分布模式，因此確定微生物群落組成的結(jié)構(gòu)模式及其背后的組裝機(jī)制是非常必要的[37]。對每一種腸型的特性研究，發(fā)現(xiàn)共存的微生物網(wǎng)絡(luò)中心存在一種驅(qū)動類群，即這一類微生物與給定的腸型最相關(guān)。在人類的微生物組學(xué)研究中，一種常用的腸型劃分方法是基于腸道菌群的屬分類學(xué)水平分類進(jìn)行劃分，大致可以分為3 個腸型：腸型1（ET B）、腸型2（ET P）和腸型3（ET F）[38]。盡管動物的腸道菌群與人類不同，但是在控制實(shí)驗(yàn)中，聚類方法可以將小鼠的腸道菌群劃分成明顯的集群，這表明，當(dāng)沒有外部因素影響微生物群落時(shí)，更容易出現(xiàn)聚集的群落狀態(tài)[38]。因此，腸型并不是人體腸道菌群特有的，動物中同樣存在這些現(xiàn)象。將數(shù)據(jù)上傳到腸型在線分類器主頁（http://enterotypes.org/），得到腸型分類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中1類腸型的比例上升，3類腸型的比例下降。這個差異變化，在圖8中也得到了驗(yàn)證。通過飼喂元寶楓籽影響了實(shí)驗(yàn)組中小鼠群體的腸型結(jié)構(gòu)組成，這為其他研究人員做相關(guān)平行研究提供了參比數(shù)據(jù)。