李安琪，黃曉君，聶少平，殷軍藝*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

動(dòng)態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一種新興的高壓均質(zhì)手段，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)改性、微生物抑制、飲料均質(zhì)、碳水化合物改性[1-3]等方面。該技術(shù)利用高壓使物料在高速通過狹縫的過程中受到劇烈旋轉(zhuǎn)、高速剪切、高頻振蕩等綜合作用，實(shí)現(xiàn)物料的細(xì)化和均一化[4-5]，從而達(dá)到增加物料穩(wěn)定性的作用。已有研究表明，DHPM技術(shù)可有效提高大豆膳食纖維中可溶性膳食纖維的含量，降低不可溶性膳食纖維的含量，從而提高豆制品的穩(wěn)定性[6-7]。同時(shí)，有研究報(bào)道，DHPM技術(shù)會(huì)引起致敏性免疫球蛋白的構(gòu)象變化和促進(jìn)免疫球蛋白與多糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，從而降低致敏性免疫球蛋白的抗原性，進(jìn)而降低免疫球蛋白的致敏性[8-9]。

蕓豆富含人體所需營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、酚類、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素等[10]，其中淀粉和非淀粉多糖的含量較高[11]。目前有關(guān)蕓豆化學(xué)成分的研究主要集中在淀粉、蛋白質(zhì)、植物凝集素、酶抑制劑、抗氧化劑、黃酮等化合物的結(jié)構(gòu)與生物活性功能方面[12-15]；其中蕓豆多糖具有較強(qiáng)的降低餐后血糖水平的功效，搭配日常主食食用可以達(dá)到預(yù)防糖尿病的目的[16-17]?，F(xiàn)有的報(bào)道顯示，在化學(xué)結(jié)構(gòu)方面，蕓豆中的非淀粉多糖主要為果膠成分，如Shiga等[18]從蕓豆子葉提取出果膠水溶性多糖，發(fā)現(xiàn)主要重復(fù)片段是木糖半乳糖醛酸聚糖型果膠，分支主要是由寡聚阿拉伯糖和短鏈半乳聚糖構(gòu)成。

現(xiàn)代豆制飲品在加工過程中常利用均質(zhì)技術(shù)提高其穩(wěn)定性，但是部分研究顯示DHPM可以改變多糖的結(jié)構(gòu)特性[19]，從而改變多糖的理化性質(zhì)。因此研究DHPM處理對(duì)蕓豆多糖的影響，對(duì)于將蕓豆應(yīng)用于豆類飲料制品中具有潛在價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)紅蕓豆多糖（red kidney bean polysaccharide，RKBP）進(jìn)行DHPM處理，分析其均質(zhì)前后的基本結(jié)構(gòu)特征、流變性質(zhì)和固體形貌等變化，以期為今后相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅蕓豆產(chǎn)地為山西省朔州市朔城區(qū)，清洗種子表面的雜質(zhì)后自然干燥，密封保存。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、鼠李糖（rhamnosus，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）） 美國Sigma公司；木糖（xylose，Xyl） 北京百靈威公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（T-10、T-40、T-50、T-70、T-500、T-2000） 美國Pharmacia公司；牛血清白蛋白 美國Amersco公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海阿拉丁生化科技股份公司；濃硫酸、苯酚、3-苯基酚、四硼酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-7125-30型微射流均質(zhì)機(jī) 美國Microfluidics公司；E2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；Dionex ICS 5000離子交換色譜系統(tǒng)、Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；12 L立式冷凍干燥機(jī) 美國LABCONCO公司；T-9雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；熱重（thermal gravimetric，TG）分析儀美國PE公司；ARES-G2流變儀 美國TA公司；JSM 6701F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（配有能譜儀） 日本電子株式會(huì)社；AVIII 400 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 可溶性RKBP提取

紅蕓豆粉碎后過40 目篩，稱取一定量的蕓豆粉，以1∶5的料液比加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液浸泡24 h，揮干乙醇后，再以料液比1∶20加入蒸餾水，95 ℃攪拌4 h，過濾、去渣。提取液分別用α-淀粉酶（95 ℃、1 h）、蛋白酶（60 ℃、0.5 h）、糖化酶（60 ℃、0.5 h）酶解，100 ℃滅酶10 min，冰浴冷卻，離心（5 000 r/min，10 min）收集上清液。上清液濃縮至原體積的1/3，加入乙醇沉淀。離心收集沉淀，蒸餾水復(fù)溶后透析48 h，濃縮，冷凍干燥，得到可溶性RKBP。

1.3.2 DHPM處理RKBP

RKBP配制成20 mg/mL的溶液，磁力攪拌至充分溶解，分別使用40、80、120 MPa的壓力對(duì)多糖樣品進(jìn)行均質(zhì)處理，每個(gè)壓力下均循環(huán)處理3 次，然后通過離心（10 000 r/min、4 ℃、15 min）去除沉淀，透析48 h，濃縮，冷凍干燥，收集均質(zhì)后多糖，不同壓力（40、80、120 MPa）處理樣品依次命名為：RKBP-40M、RKBP-80M、RKBP-120M。

1.3.3 基本理化性質(zhì)分析

以Glc為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[20]測(cè)定中性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以GlaA為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯法[21]測(cè)定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定多糖中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)[22]。

1.3.4 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

將多糖用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，用0.22 μm尼龍濾膜過濾進(jìn)樣，采用高效體積排阻色譜法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）-多角度激光光散射（multiangle laser light scattering，MALLS）系統(tǒng)分析檢測(cè)。

HPSEC-MALLS系統(tǒng)參數(shù)：高效液相色譜泵（Model 1500）、保護(hù)柱P8514-000、串聯(lián)SB-804HQ和SB-806HQ色譜柱、檢測(cè)系統(tǒng)（MALLS檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、黏度檢測(cè)器）。流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3（含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% NaN3），流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量為100 μL。利用ASTRA 6.1軟件采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 單糖組成分析

準(zhǔn)確稱取5 mg樣品于厚壁耐壓瓶中，加入0.5 mL 12 mol/L硫酸在冰浴條件下磁力攪拌30 min，然后加入2.5 mL超純水，100 ℃條件下油浴攪拌反應(yīng)2 h，充分冷卻，將樣品全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容并搖勻，再稀釋5 倍體積后過0.22 μm水系濾膜，采用離子交換色譜儀進(jìn)樣分析[29]。

準(zhǔn)確稱取5 mg Fuc、Rha、Ara、Glc、Gla、Man、Xyl、Fru、GlaA、GlcA標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容搖勻，配制成單糖混標(biāo)母液。將母液梯度稀釋為不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液，過0.22 μm水系濾膜，采用離子交換色譜儀進(jìn)樣分析。

檢測(cè)條件為保護(hù)柱：Dionex CarboPacTMPA20（30 mm×3 mm）；色譜柱：Dionex CarboPacTMPA20（150 mm×3 mm）；流動(dòng)相：1 mol/L醋酸鈉、250 mmol/L氫氧化鈉、超純水。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

單糖相對(duì)含量按下式計(jì)算。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品真空干燥12 h，取適量樣品和溴化鉀充分混勻、研磨，壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1區(qū)內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行掃描分析。

1.3.7 熱穩(wěn)定性分析

稱取適量樣品放入TG分析儀，分析不同壓力處理多糖的熱穩(wěn)定性。測(cè)試條件：掃描溫度：30～700 ℃：升溫速率：10 ℃/min；N2流速：20 mL/min。

1.3.8 表觀黏度分析

將高壓微射流處理前后RKBP樣品配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的溶液，充分溶解，于25 ℃室溫靜置12 h，利用ARES-G2流變儀測(cè)定其表觀黏度（夾具直徑為40 mm，測(cè)定間隙為0.046 mm），測(cè)試溫度為25.0 ℃，剪切速率0.01～1 000 s-1，采用TA Orchestrator-7軟件采集數(shù)據(jù)。

1.3.9 SEM觀察

將高壓微射流處理前后RKBP樣品配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，充分溶解，于液氮中固定10 min，冷凍干燥，采用Model IB-3離子鍍膜機(jī)進(jìn)行噴金處理，于SEM下觀察，通過XT Microscope Control軟件采集圖譜。

1.3.10 NMR分析

稱取高壓微射流處理前后RKBP樣品50 mg，溶于12 mL重水，冷凍干燥，重復(fù)3 次。經(jīng)重水交換后的樣品溶于0.55 mL重水，充分溶解，室溫靜置12 h后，進(jìn)行NMR測(cè)試，得到1H NMR圖譜，所有樣品均在293 K條件下測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)不同均質(zhì)壓力處理的樣本進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHPM處理對(duì)RKBP基本理化性質(zhì)的影響

表1為DHPM處理對(duì)RKBP基本理化性質(zhì)影響的測(cè)定結(jié)果。經(jīng)DHPM處理后的樣品中性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高，樣品中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈一定的下降趨勢(shì)，由1.82%最低下降至1.03%，已有研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)過高壓均質(zhì)作用后，其分子粒徑減小，暴露出更多的帶電基團(tuán)，分子間靜電排斥力增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致其親水性、流動(dòng)性增加[23]。因此結(jié)合樣品制備過程分析，可能是蛋白質(zhì)經(jīng)DHPM處理后粒徑減小、溶解性增強(qiáng)，在樣品制備后期的透析過程中流失；因此，樣品中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低。上述結(jié)果顯示，經(jīng)過高壓微射流均質(zhì)處理后，樣品的糖含量有一定提升。在不同壓力處理下，樣品得率為68%～81%，這可能是樣品進(jìn)入均質(zhì)機(jī)前的適當(dāng)潤(rùn)洗、少量樣品均質(zhì)時(shí)在儀器中的殘留，以及均質(zhì)后樣品離心時(shí)損失了少量不溶物造成的[24]。

表1 DHPM處理前后RKBP的基本理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of RKBP before and after DHPM treatment

2.2 DHPM處理對(duì)RKBP表觀黏度的影響

從圖1可知，隨著剪切速率的增加，樣品的表觀黏度呈下降趨勢(shì)，說明樣品屬于典型的非牛頓流體。這可能是由于多糖在DHPM處理過程中，由于高剪切力和湍流力造成了有序或無序的構(gòu)象轉(zhuǎn)變以及多糖分子鏈的斷裂，致使其黏度降低[25]。也有研究表明，微射流造成樣品黏度下降可能是因?yàn)槎嗵沁@類聚合物在高剪切力和湍流力作用下相對(duì)分子質(zhì)量被平均化[26]。剪切速率較低時(shí)，RKBP-40M、RKBP-80M的表觀黏度和RKBP差異不明顯，而RKBP-120M的黏度明顯小于另外3 個(gè)樣品。隨剪切速率的增加，DHPM處理后的樣品表觀黏度下降趨勢(shì)更大，剪切稀化的效果更加明顯。綜上可知，DHPM處理可以有效地降低RKBP的表觀黏度，增加固形物的沉降率，離心處理后有利于除去固形物，從而增加溶液穩(wěn)定性[27]。

圖1 DHPM處理前后RKBP表觀黏度隨剪切速率變化情況Fig. 1 Changes in apparent viscosity of RKBP with high shearing rate before and after DHPM treatment

2.3 DHPM處理對(duì)RKBP相對(duì)分子質(zhì)量、特性黏度等指標(biāo)的影響

圖2 DHPM處理前后RKBP的HPSEC示差檢測(cè)色譜圖Fig. 2 HPSEC chromatogram with differential detection of RKBPbefore and after DHPM treatment

圖2 為RKBP的示差檢測(cè)器信號(hào)，其相對(duì)分子質(zhì)量分布較寬，主要含有峰1和峰3這兩個(gè)組分，此外還含有少量的峰2組分。經(jīng)過DHPM處理后，峰1組分對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間逐漸后移，表明多糖的相對(duì)分子質(zhì)量下降，隨著處理壓力增加，峰1組分相對(duì)分子質(zhì)量下降更加明顯，但是對(duì)峰2和峰3組分的相對(duì)分子質(zhì)量影響相對(duì)較小。

表2 HPSEC-MALLS測(cè)定DHPM處理前后RKBP的分子參數(shù)Table 2 Molecular parameters of RKBP before and after DHPM treatment estimated by high performance size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering analysis

由于峰3組分相對(duì)分子質(zhì)量較小，因此主要對(duì)峰1和峰2兩個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量等參數(shù)進(jìn)行了分析。DHPM處理前后樣品峰1的變化主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：示差出峰信號(hào)變化和峰寬變化。峰1示差出峰信號(hào)明顯向后推移，說明峰1相對(duì)分子質(zhì)量顯著下降，由表2可知，DHPM處理壓力越大，DHPM的峰1相對(duì)分子質(zhì)量越小，同時(shí)峰1的特性黏度也下降，這與樣品的表觀黏度下降現(xiàn)象相一致。峰2組分的相對(duì)分子質(zhì)量等指標(biāo)也有一定下降。綜上表明，DHPM處理能降低RKBP的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.4 DHPM處理對(duì)RKBP單糖組成的影響

表3 DHPM處理前后RKBP的單糖組成及其相對(duì)含量變化Table 3 Monosaccharide composition of RKBP before and after DHPM treatment

由表3可知，RKBP主要含有Rha、Ara、Xyl、GalA和Gal，表明RKBP屬于果膠類多糖[28]。原樣的Gal相對(duì)含量與DHPM處理后的樣品存在顯著性差異，且不同壓力處理的樣品之間也差異顯著，Gal相對(duì)含量由1.55%隨處理壓力增加依次上升至8.25%、6.95%、8.60%，變化幅度較大；Glc相對(duì)含量與DHPM處理后的樣品也由5.65%顯著下降至1.25%、0.45%、1.45%；此外，GalA、Ara的相對(duì)含量也均隨DHPM壓力的升高而顯著增加，但不同壓力處理的樣品之間差異不顯著。

結(jié)合文獻(xiàn)分析造成單糖組成變化的原因，可能是由于：1）經(jīng)DHPM處理后再離心可以除去少量沉淀物質(zhì)，使得均質(zhì)后的多糖純度在一定程度上有所提升，導(dǎo)致一部分單糖含量有所提升；2）經(jīng)DHPM處理后，多糖糖鏈上斷裂的單糖（尤其是側(cè)鏈和末端殘基）在透析過程中流失，造成部分單糖測(cè)定結(jié)果下降[29]。此外，DHPM過程導(dǎo)致多糖大分子鏈斷裂（相對(duì)分子質(zhì)量降低），在相同水解條件下，經(jīng)DHPM處理后得到的多糖水解效率更高，因此總糖含量也更高。

2.5 DHPM處理對(duì)RKBP傅里葉變換紅外光譜的影響

圖3 DHPM處理前后RKBP傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transfer infrared spectra of RKBP before and after DHPM treatment

由圖3可知，3 413.5 cm-1附近的吸收峰為O—H伸縮振動(dòng)，2 927.6 cm-1附近的吸收峰為C—H伸縮振動(dòng)，1 200～1 414 cm-1附近的吸收峰為C—H彎曲振動(dòng)，這3 個(gè)峰是糖類特征吸收峰，由此推斷RKBP是糖類化合物。1 650.1 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰為羧基特征吸收峰，證明RKBP是酸性多糖，1 046.9 cm-1附近的吸收峰證明存在C—O—C[30]。DHPM處理前后多糖的傅里葉變換紅外光譜差異不明顯，說明DHPM對(duì)RKBP的官能團(tuán)影響較小。

2.6 DHPM處理對(duì)RKBP固體形貌的影響

圖4 DHPM處理前后RKBP的SEM圖（1 000×）Fig. 4 Scanning electron microscopic images of RKBP before and after DHPM treatment (1 000 ×)

從圖4可以看出，RKBP最顯著的特征是表面形貌起伏不平，鏈結(jié)構(gòu)邊緣有球狀物，無規(guī)則地卷曲排布，空間間隙較大。RKBP-40M的絲狀結(jié)構(gòu)比RKBP的絲狀結(jié)構(gòu)更細(xì)，高壓下（80、120 MPa）處理得到的RKBP-80M和RKBP-120M，多糖鏈出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，鏈邊緣的球狀結(jié)構(gòu)數(shù)量增加，空間間隙變小，且RKBP-120M的團(tuán)聚現(xiàn)象比RKBP更為嚴(yán)重。上述結(jié)果表明，DHPM處理對(duì)RKBP的固體形貌有一定影響。

2.7 DHPM處理對(duì)RKBP的1H NMR譜圖特征的影響

由圖5可知，雖然前期利用較多經(jīng)典的多糖提取和分離純化手段處理，但所得樣品的結(jié)構(gòu)仍比較復(fù)雜，在δ 0.96～2.73分布了較多非碳水化合物的信號(hào)峰，這些信號(hào)可能來自于氨基酸，這與理化性質(zhì)分析中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)結(jié)果相印證。在δ 3.75的一個(gè)非常強(qiáng)的信號(hào)峰代表羧基上的甲基，結(jié)合單糖組成分析證明GalA的存在[31]。在δ 2.06附近的一個(gè)較強(qiáng)的信號(hào)峰是GalA乙酰化的結(jié)果[32]。在δ 1.20、1.28的信號(hào)峰證明了Rha的存在[33]，這與單糖組成的結(jié)果一致。對(duì)比高壓微射流前后樣品的異頭氫區(qū)域（δ 4.5～5.5）信號(hào)峰，發(fā)現(xiàn)DHPM處理后RKBP的1H NMR譜峰型沒有明顯的變化。

圖5 DHPM前后RKBP的1H NMR譜圖（293 K）Fig. 5 1H nuclear magnetic resonance spectra of RKBP before and after DHPM treatment (293 K)

2.8 DHPM處理對(duì)RKBP熱穩(wěn)定性的影響

圖6 DHPM處理前后RKBP的TG圖Fig. 6 Thermogravimetric plots of RKBP before and after DHPM treatment

圖6 是DHPM前后RKBP的TG曲線測(cè)定結(jié)果，對(duì)RKBP熱降解而言，結(jié)合參考文獻(xiàn)[34]分析，主要存在4 個(gè)階段：第1階段是失水階段（30～110 ℃），該階段主要是隨溫度升高，水分變?yōu)闅鈶B(tài)被保護(hù)氣帶走而造成的質(zhì)量損失；第2階段是熱解準(zhǔn)備階段（110～240 ℃），該階段質(zhì)量幾乎不變，主要發(fā)生多糖的解聚；第3階段是熱解質(zhì)量損失階段（240～400 ℃），在這個(gè)階段多糖、淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生軟化和分解，大部分物質(zhì)生成揮發(fā)性物質(zhì)，導(dǎo)致質(zhì)量大幅下降，部分物質(zhì)炭化，質(zhì)量損失約為50%；第4階段為炭化階段（400～700 ℃），該階段主要是殘留物的緩慢分解，質(zhì)量損失速率較為平緩，質(zhì)量損失約為13%，主要發(fā)生物質(zhì)的炭化和聚合，最終生成焦炭被剩下，生成的氣體被保護(hù)氣帶走。

經(jīng)過DHPM處理后所得各種多糖的TG圖與RKBP相似，表明DHPM處理對(duì)RKBP的熱穩(wěn)定性影響不明顯。

3 結(jié) 論

以RKBP為研究對(duì)象，采用DHPM的不同壓力對(duì)其進(jìn)行加工處理，探究DHPM對(duì)RKBP基本結(jié)構(gòu)特征、流變性質(zhì)和固體形貌等指標(biāo)的影響。RKBP經(jīng)過DHPM處理后得率降低，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨壓力的增加而升高，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所提高，單糖組成出現(xiàn)差異；RKBP的表觀黏度、相對(duì)分子質(zhì)量（主要是影響高分子質(zhì)量組分峰1）隨處理壓力的增大而減?。籗EM觀察結(jié)果說明隨著壓力升高，多糖固體形貌變化愈加明顯。由傅里葉變換紅外光譜結(jié)果可知，DHPM處理未對(duì)多糖官能團(tuán)特征峰產(chǎn)生明顯的影響；RKBP的TG分析結(jié)果顯示均質(zhì)前后樣品無明顯差異，說明化學(xué)成分沒有明顯變化。1H NMR譜圖表明DHPM前后樣品的總體峰型無明顯區(qū)別。因此，結(jié)合DHPM技術(shù)將蕓豆應(yīng)用于飲料工業(yè)中可增加飲料穩(wěn)定性且不破壞蕓豆多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可行性較高，具有一定的研究意義。